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Häufig gestellte Fragen zu Produkten und Dienstleistungen

Die passende Antwort auf häufig gestellte Fragen

Finden Sie erklärende Informationen zu unseren Produkten und Dienstleistungen, indem Sie auf die folgenden Links klicken.

Next Generation Sequencing

Fragen zu Inview De Novo Genome

Wo bekomme ich meine Ergebnisse?

Alle Rohdaten sowie die analysierten und assemblierten Daten können über Ihr sicheres Online-Konto heruntergeladen werden. Beispieldaten der De novo-Assemblierung von E. coli DH1 können in der Sektion "Dateien" eingesehen werden. 

Was für eine Abdeckung soll ich verwenden?

In internen Tests konnte gezeigt werden, dass eine Abdeckung von ca. 25-30x mit korrigierten PacBio RS II-Reads zur Gewinnung hochwertiger Genomassemblierungen ausreichend ist. Dies entspricht einer wahrscheinlichen Rohdaten-Abdeckung von ca. 100x. Die Ergebnisse der Assemblierung sind zum großen Teil von der Zusammensetzung des analysierten Genoms abhängig und kann zwischen verschiedenen Organismen schwanken. 

Was für ein Ausgangsmaterial soll ich schicken und wie viel?

Für die Sequenzierung auf dem PacBio RS II ist es entscheidend, qualitativ hochwertige DNA als Ausgangsmaterial zu verwenden. Bei Verwendung von zu wenig oder degradiertem, kontaminiertem oder anderweitig geschädigtem Ausgangsmaterial kann die Folge ein sehr niedriger Ertrag, eine fehlgeschlagene Probenvorbereitung sowie eine beeinträchtigte Qualität und Quantität der Sequenzierungsergebnisse sein. Für optimale Ergebnisse benötigen wir mindestens 8 µg aufgereinigte RNA-freie Doppelstrang-DNA mit hohem Molekulargewicht (Konzentration ca. 80 ng/µl; OD 260/280 ≥ 1,8; OD 260/230 ≥ 2,0).

Garantieren Sie einen bestimmten Output?

Die Sequenzdaten werden unter Berücksichtigung aller Reads-Informationen und unter Verwendung optimierter Programme und Parameter de novo assembliert. Die Anzahl an zusammenhängenden Sequenzen (Contigs), die unzweideutig assembliert werden können, hängt von der Komplexität (Häufigkeit, Länge und Verteilung stark repetitiver oder duplizierter Regionen) des sequenzierten Genoms sowie auch von der Qualität des zur Verfügung gestellten Ausgangsmaterials ab. Daher können wir keine Mindestanzahl von Contigs garantieren.

Welche Art von Qualitätskontrollen führen Sie durch?

Qualität und Quantität jeder eingehenden Probe werden mit entsprechenden Methoden bestimmt. Weitere Qualitätskontrollen erfolgen bei verschiedenen Schritten des Prozesses.

Wohin soll ich meine Proben schicken?

Eurofins Genomics Europe Sequencing GmbH
Jakob-Stadler-Platz 7
78467 Konstanz
Germany

Fragen zu Inview Human Exome Advance

Wie sieht der Prozess der Datenverarbeitung aus (einschließlich Ingenuity® Variant Analysis™ von QIAGEN)?

Alle Rohdaten werden analysiert und in eine VCF-Datei konvertiert, die direkt auf die webbasierte Software-Plattform von QIAGEN hochgeladen wird. Die Zugangsdaten zu Ihrem Konto erhalten Sie von Eurofins Genomics

Darüber hinaus erfolgt die Lieferung der Alignment-Datei (BAM), der SNP- und InDel-Tabellen (VCF und TSV) und des Datenanalyseberichts (PDF) von Eurofins Genomics.

Bitte beachten: Der Kunde muss dem Endbenutzer-Lizenzvertrag von QIAGEN zustimmen, damit der Zugriff auf das Produkt Variant Analysis oder die von diesem Produkt generierten Ergebnisse gewährt wird.

Wie lange habe ich Zugriff auf meine Daten auf meinem QIAGEN-Konto?

Die Lizenz gewährt Ihnen einen sechsmonatigen Erstzugriff auf die Analysesoftware. Nach Ablauf dieses Zeitraums haben Sie die Möglichkeit, die Lizenz zu erneuern; die Erneuerung kann jedoch nur offline erworben werden. Bitte sprechen Sie uns an!

Wo bekomme ich meine Ergebnisse, wenn ich nur die optionale BioIT wähle?

Alle Rohdaten sowie die analysierten Daten können über Ihr gesichertes Konto heruntergeladen werden. 

Was für eine Abdeckung soll ich verwenden?

Zum Auffinden von SNPs in heterozygoten Organismen empfehlen wir mindestens eine 30x-Abdeckung. Eine höhere Abdeckung erhöht die Zuverlässigkeit der SNP-Auffindung. Eine zuverlässige Aufdeckung von genetischen Varianten in inhomogenen Proben wie etwa aus normalen Zellen und Tumorzellen extrahierter DNA erfordert eine höhere Gesamtabdeckung. Die zum Erreichen einer bestimmten Abdeckung auf der interessierenden DNA benötigte Datenmenge ist vom Verhältnis von normaler DNA zu Tumor-DNA abhängig. Bitte beachten Sie, dass auf Grund der unterschiedlichen Effizienz der für die Anreicherung verwendeten Baits die Zielregionen nicht gleichmäßig abgedeckt werden (siehe unten). 

Wie handhaben Sie PCR-Duplikate?

Die Häufigkeit von PCR-Duplikaten ist direkt mit Qualität und Menge des Ausgangsmaterials korreliert. Die Library-Erstellung mit weniger als der empfohlenen Menge an DNA erfordert zusätzliche PCR-Zyklen, damit genügend Material zum Beladen des Sequenziergeräts erzeugt wird. Die Häufigkeit von PCR-Duplikaten hängt daher von der Probe ab und kann von GATC Biotech nicht beeinflusst werden. 
Duplikate sind aus der Berechnung der durchschnittlichen zielgerichteten Abdeckung nicht ausgeschlossen. Gemäß unserer Erfahrung mit der Sequenzierung humaner Proben erzielen wir für qualitativ hochwertige DNA in der Regel PCR-Duplikatraten von ca. 5 %. 
 
Wenn weitere bioinformatische Analysen (z. B. SNP-Identifizierung) in Auftrag gegeben werden, dann wird nur eine Kopie des doppelten Read-Paares im Alignment behalten. Der Rest wird zur Vermeidung eines Bias aus der weiteren Analyse ausgenommen.

Was für ein Ausgangsmaterial soll ich schicken? In welchen Mengen?

Für optimale Ergebnisse benötigen wir mindestens 100 ng aufgereinigte RNA-freie Doppelstrang-DNA mit hohem Molekulargewicht (Konzentration ≥ 1 ng/µl; OD 260/280 ≥ 1,8; OD 260/230 ≥ 2,0). Für DNA von FFPE-Proben benötigen wir mindestens 200 ng DNA. 

Eine Kontamination durch DNA von anderen Spezies (> 3 %, insbesondere von nah verwandten Spezies) könnte die Anreicherung der humanen DNA stören und reduziert zudem die Gesamtmenge an humaner DNA in der gesendeten Probe. Akzeptiert wird in der Regel amplifizierte Gesamtgenom (WGA)-DNA oder DNA aus archiviertem Gewebe, wie beispielsweise Formalin-fixierte, Paraffin-eingebettete (FFPE) Proben. Wenden Sie sich an uns, wenn Sie Einzelheiten wissen möchten. 

Was meinen Sie mit überlappenden Reads?

Die Fragmentierung genomischer DNA nach dem Agilent SureSelectXT-Protokoll und die darauffolgende Weiterverarbeitung ergeben eine Normalverteilung von DNA-Fragmenten mit unterschiedlichen Längen. Ein kleiner Prozentsatz der entstandenen Library-Fragmente haben eine Insert-Größe von weniger als 250 bp. Die Sequenzierung dieser Library-Fragmente mit Paired-End-Reads von 150 bp erzeugt teilweise überlappende Reads, welche die gleichen Basen abdecken; somit entsteht eine künstliche Verdoppelung der Abdeckung an diesen Stellen. Zur Gewährleistung präziser Analysen werden diese Basen aus weiteren Analysen (z. B. Erkennung von Einzelnukleotid-Varianten und Insertionen/Deletionen) ausgeschlossen. Darüber hinaus werden die Protokolle bei Eurofins Genomics fortlaufend mit dem Ziel optimiert, die Anzahl an überlappenden Basen auf ein Minimum zu reduzieren.

Wie sieht die Qualität der Daten aus?

Bei der Sequenzierung von humanen Proben im Paired-End-Modus (150 bp) erzielt Eurofins Genomics in der Regel über 80 % Basecalls mit einem Qualitätswert von mehr als Q30 (> 99,9 % Genauigkeit). 

Garantieren Sie einen bestimmten zielgenauen Output?

Für Proben, die die erste Qualitätskontrolle bei Eurofins Genomics erfolgreich bestanden haben, garantieren wir Ihnen den Ziel-Output, den Sie bestellt haben. Die durchschnittliche zielgenaue Abdeckung wird berechnet als Summe der kartierten Basen in jeder Zielposition dividiert durch die Anzahl der Basen in der Zielregion (Zielbasen / Größe der Zielregion).

Welche Gene werden angereichert?

Die Zielregion entspricht den Bait-Koordinaten des SureSelectHuman All Exon V6 Kits von Agilent: ca. 60 Mbp der exonischen Basen (> 93 % der Ziele werden mit > 20x, 90 % der Gene werden vollständig abgedeckt – alle Exons – 10 % der Gene werden teilweise abgedeckt).

Werden alle Gene bei 30x abgedeckt?

Auf Grund der unterschiedlichen Effizienz der zur Anreicherung verwendeten Baits (z. B. GC/AT-Gehalt) werden Zielregionen unterschiedlich abgedeckt und die Reichweite und Einheitlichkeit der Abdeckung schwanken innerhalb der Zielregion. Eurofins Genomics wendet das neueste Human All Exon Kit-Design (V6) von Agilent an, das verbesserte Design-Algorithmen aufweist und somit schwierige Regionen besser erfassen und eine hervorragende Einheitlichkeit der Abdeckung bieten kann.

Welche Art von Qualitätskontrollen führen Sie durch?

Qualität und Quantität jeder eingehenden Probe werden mit entsprechenden Methoden bestimmt. Weitere Qualitätskontrollen erfolgen bei verschiedenen Schritten des Prozesses.

Wohin soll ich meine Proben schicken?

Eurofins Genomics Europe Sequencing GmbH
Jakob-Stadler-Platz 7
78467 Konstanz
Germany

Fragen zu Inview Human Exome Explore

Welche Art von Proben kann mit Inview Human Exome Explore verarbeitet werden?

Als Ausgangsmaterial für Inview Human Exome Explore akzeptieren wir Gewebe, Zellen und Blut. Amplifizierte Gesamtgenom (WGA)-DNA oder DNA aus archiviertem Gewebe, wie beispielsweise Formalin-fixierte, Paraffin-eingebettete (FFPE) Proben, werden in der Regel ebenfalls akzeptiert. Wenden Sie sich an uns, wenn Sie Einzelheiten wissen möchten.

Wie viel Ausgangsmaterial soll ich versenden?

Die Datengenerierung gilt nur für frisch isolierte, nicht amplifizierte und reine humane DNA-Proben (mindestens 100 ng). Bitte beachten Sie, dass Verunreinigungen durch DNA anderer Spezies (> 3 %; insbesondere von eng verwandten Organismen) die Gesamtmenge an humaner DNA in der gelieferten Probe reduziert und die Anreicherung der Exon-Region stören könnte.

Welche Gene werden angereichert?

Die Zielregion entspricht den Bait-Koordinaten des SureSelect Human All Exon V6 Kits von Agilent: 60,7 Mbp an exonischen Basen, die > 20.000 Gene im menschlichen Genom abdecken.

Wie werden bei Ihnen PCR-Duplikate gehandhabt?

Die Häufigkeit von PCR-Duplikaten ist direkt mit Qualität und Menge des zur Verfügung gestellten Ausgangsmaterials korreliert. Daher hängt die Häufigkeit von PCR-Duplikaten von der Probe ab und kann von Eurofins Genomics nicht beeinflusst werden.

Gemäß unserer Erfahrung mit der Sequenzierung humaner Proben erhalten wir für qualitativ hochwertige DNA in der Regel PCR-Duplikatraten von ca. 5 %. Wenn weitere bioinformatische Analysen (z. B. SNP-Identifizierung) in Auftrag gegeben werden, dann wird nur ein Exemplar des doppelten Read-Paares im Alignment behalten. Die restlichen Duplikate werden zur Vermeidung eines Bias aus der weiteren Analyse ausgenommen.

Werden alle Gene mit 10 Millionen Read-Paaren abgedeckt?

Auf Grund der unterschiedlichen Effizienzen der zur Anreicherung verwendeten Baits (z. B. GC/AT-Gehalt) werden Zielregionen unterschiedlich abgedeckt und die Reichweite und Abdeckung schwanken innerhalb der Zielregion. Eurofins Genomics wendet das neueste Human All Exon Kit-Design (V6) von Agilent an, das verbesserte Design-Algorithmen aufweist und somit schwer zu erfassende Regionen besser erfassen und eine hervorragende Einheitlichkeit der Abdeckung bieten kann.

Was meinen Sie mit überlappenden Reads?

Die Fragmentierung genomischer DNA nach dem Agilent SureSelectXT2-Protokoll und die darauffolgende Weiterverarbeitung ergeben eine Normalverteilung der verschiedenen DNA-Fragmentgrößen. Ein kleiner Prozentsatz der entstandenen Fragmente hat eine Insert-Größe von weniger als 300 bp. Die Sequenzierung dieser kleinen Bibliothek-Fragmente mit Paired-End-Reads von 150 bp erzeugt teilweise überlappende Reads, welche die gleichen Basen abdecken; somit entsteht eine künstliche Verdoppelung der Abdeckung an diesen Stellen. Zur Gewährleistung präziser Analysen werden diese Basen aus weiteren Analysen wie z. B. Erkennung von Einzelnukleotid-Varianten (SNV) und Insertionen/Deletionen (InDel) ausgeschlossen. Eurofins Genomics arbeitet kontinuierlich an der Optimierung der Protokolle mit dem Ziel, die Anzahl der überlappenden Reads zu minimieren.

Wie sieht die Qualität der Daten aus?

Bei humanen Proben, die im Paired-End-Modus (150 bp) sequenziert werden, erzielt Eurofins Genomics in der Regel über 80 % der Basecalls mit einem Qualitätswert von mehr als Q30 (> 99,9 % Genauigkeit).

Wo bekomme ich meine Ergebnisse und in welcher Form werden sie geliefert?

Die Lieferung der Alignment-Datei (BAM), der SNP- und InDel-Tabellen (VCF und TSV) sowie des Datenanalyseberichts (PDF) erfolgt in den angegebenen Formaten auf Ihr Konto.

Wie funktioniert die Datenverarbeitung mit der Ingenuity Variant Analysis von QIAGEN?

Sollten Sie sich für den optionalen Zugriff auf die Plattform der Ingenuity Variant Analysis von QIAGEN entscheiden, werden alle Rohdaten analysiert, in eine VCF-Datei konvertiert und dann direkt auf die web-basierte Software-Plattform von QIAGEN hochgeladen. Die Zugangsdaten zu Ihrem persönlichen Konto erhalten Sie von Eurofins Genomics.

Bitte beachten! Der Kunde muss den Endbenutzer-Lizenzvertrag von QIAGEN akzeptieren, bevor der Zugriff auf die Ingenuity Variant Analysis sowie alle von diesem Dienst generierten Daten gewährt wird.

Wie lange habe ich Zugriff auf meine Daten auf meinem QIAGEN-Konto?

Die Lizenz gewährt einen sechsmonatigen Zugriff auf die Analysesoftware. Nach Ablauf dieser Frist kann eine optionale Verlängerung der Lizenz ausschließlich offline erworben werden – Bitte sprechen Sie uns an!

Welche Art von Qualitätskontrollen führen Sie durch?

Qualität und Quantität jeder Probe werden bei Eingang der Probe bestimmt. Weitere Qualitätskontrollen erfolgen bei verschiedenen Schritten des Prozesses.

Welches Produkt soll ich wählen – Inview Exome Explore oder Inview Exome Advance?

Sowohl Inview Exome Explore als auch Inview Exome Advance sind hervorragende Komplettlösungen für die Gesamtexom-Sequenzierung. Die Produkte bieten Sequenzierung nach Diagnosenormen (ISO 17025) sowie vergleichbare BioIT-Pipelines für die Datenanalyse. Darüber hinaus bieten beide Dienste eine ergänzende Datenverarbeitung mit der Ingenuity Variant Analysis von QIAGEN. Die beiden Produkte unterscheiden sich geringfügig hinsichtlich ihrer Workflows, Anwendungen und den damit verbundenen Kosten.

Inview Exome Explore ist die kostengünstigste Lösung für die Gesamtexom-Sequenzierung. Das Produkt ist ideal für die Analyse von Keimbahnmutationen. 

Inview Exome Advance ist eine flexiblere Lösung für die Gesamtexom-Sequenzierung. Inview Exome Advance wird mit einer garantierten durchschnittlichen zielgerichteten Abdeckung in Vielfachen von 30x angeboten. Das Produkt kann zur Analyse sowohl von Keimbahnmutationen als auch von somatischen Mutationen verwendet werden.

Wohin soll ich meine Proben schicken?

Eurofins Genomics Europe Sequencing GmbH
Jakob-Stadler-Platz 7
78467 Konstanz
Germany

Fragen zu GATCLiquid Oncopanel All-In-One

Welche Arten von Proben können mit GATCLiquid Oncopanel All-In-One verarbeitet werden?

Für GATCLIQUID ONCOPANEL ALL-IN-ONE akzeptieren wir frisches Blut (muss in BCT-Röhrchen mit einem stabilisierenden, für die cfDNA-Isolation bestimmten Puffer zur Verfügung gestellt werden) oder alternativ frische oder aufbewahrte Plasmaproben, sowie bereits isolierte zellfreie DNA. Weiteres entnehmen Sie bitte unserem Informationsblatt zur Probenvorbereitung. Die cfDNA wird aus Blutplasma extrahiert. 
Bei Ausgangsmaterial wie DNA, die aus FFPE-Proben und frisch eingefrorenen Gewebeproben isoliert wurde, sehen Sie sich bitte unser Produkt für die Charakterisierung fester Tumorproben an: INVIEW ONCOPANEL ALL-IN-ONE.

Wie viel Ausgangsmaterial wird benötigt?

Wir empfehlen die Übersendung von zwei 10 ml-Blutproben. Die erste 10 ml-Probe wird für die Tests verwendet, während die zweite Probe als Reservematerial aufbewahrt werden kann. Bei Plasmaproben ist die optimale Menge 4 ml. Bitte beachten Sie, dass die Leistung und Empfindlichkeit bei kleineren Plasmavolumen abnehmen kann. Alternativ akzeptieren wir auch 15 ng bereits isolierte zellfreie DNA(bis zu 30 µl /Konzentration > 0,5 ng/µl).

Wie erfolgt die Anreicherung der gewünschten Genabschnitte?

Die interessierenden Gene werden unter Verwendung firmeneigener Eurofins-Protokolle mit der hochmodernen Hybridisierungstechnologie SureSelect von Agilent angereichert. Das Zielregionen-Anreicherungssystem erfasst genomische Zielregionen mit Hilfe von langen 120 nt-RNA-Baits. Mit Hilfe der auf Hybridisierung basierenden Strategie können PCR-Duplikationen im Assay leicht abgezogen werden. Das Eurofins-eigene Protokoll ermöglicht die Erstellung von hochkomplexen Bibliotheken, eine tiefgreifende Abdeckung der interessierenden Regionen sowie eine verbesserte Einheitlichkeit der Sequenz. Im Anschluss an die Anreicherung der Zielregionen wird eine Next Generation Sequenzierung der Bibliothek durchgeführt.

Welche Arten von Mutationen können mit GATCLiquid Oncopanel All-In-One erkannt werden?

Das Produkt sucht die Exons von etwa 600 Genomregionen ab, die an der Entstehung von Krebs beteiligt sind. Dadurch wird eine extrem hohe Anzahl von möglichen Mutationen abgedeckt und analysiert. Zu den erkannten genomischen Aberrationen zählen SNPs, InDels, CNVs und Genfusionsereignisse.

Wie sensitiv ist das Produkt?

Die Erkennung von SNP und InDel hat eine technische Empfindlichkeit von bis zu 1 %.

Welche Art von Qualitätskontrollen führen Sie durch?

Die Qualität und Quantität jeder Probe werden bei Eingang der Probe oder nach der DNA-Extraktion bestimmt. Weitere Qualitätskontrollen erfolgen bei verschiedenen Schritten des Prozesses.

Welches Produkt soll ich wählen – GATCLiquid Oncoexome, Oncopanel All-In-One oder Oncotarget?

Alle drei Tests können bei Flüssigbiopsieproben (cfDNA) zum Einsatz kommen. Die drei Produkte dienen als leistungsstarkes, nichtinvasives Tool für die Krebsprofilierung.

GATCLiquid Oncoexome ist der erste kommerziell erhältliche Service für die Gesamtexom-Sequenzierung (WES) von cfDNA. Mit diesem Service erhalten Sie ein umfassendes Profil aller Mutationen in den proteinkodierenden Bereichen des Exoms. Dieses Produkt eignet sich für einen eingehenden Blick auf das Exom eines Krebspatienten in Fällen, in denen nur begrenzte Informationen über klinisch relevante Mutationen zur Verfügung stehen.

GATCLiquid Oncopanel All-In-One ist ein umfassendes NGS-Krebspanel zur Charakterisierung wichtiger tumorspezifischer Mutationen, die bei fast allen Krebsarten eine Rolle spielen. Mittels SureSelect von Agilent und einem optimierten GATC-Protokoll zielt dieses Panel auf 600 bekannte Krebsgene einschließlich Tumorsuppressoren, Hotspots und Resistenz-Markern. Das Panel verfügt über eine optimierte Sequenzabdeckung und Gleichförmigkeit mit einer Sensitivität von 1 %.

GATCLiquid Oncotarget ermöglicht den ultrasensitiven Nachweis von klinisch relevanten krebsspezifischen Punktmutationen, Insertionen, Deletionen und Genfusionen in zirkulierender zellfreier DNA bis zu einer Allelfrequenz von 0,1 %. Diese Methode eignet sich für die Therapieüberwachung, da sie empfindlich genug ist, um ein Rezidiv in sehr frühem Stadium zu erkennen.

Kann ich GATCLiquid Oncopanel All-In-One für diagnostische Zwecke verwenden?

Das Produkt steht nur für Forschungszwecke zur Verfügung. Alle Proben werden in Erfüllung der ISO 17025:2005-Akkreditierung verarbeitet.

Wo liegen die Grenzen der CNV-Analyse?

Auch bei Einreichung von Kontrollproben (Plasmaproben von mindestens sieben andere Patienten/Personen) kann die Methode der CNV-Analyse Einschränkungen unterliegen. Sensitivität und Spezifität des Assays hängen vom Ausmaß der vorhandenen CNV sowie vom Tumoranteil ab.

Werden alle Veränderungen der Kopienzahl in meiner Probe erkannt?

Die Heterogenität eines Tumors kann eine korrekte Identifizierung aller relevanten Kopienzahlvariationen in einer gegebenen Plasmaprobe erschweren. Darüber hinaus könnte eine übermäßige Verunreinigung mit DNA aus normalen Zellen zu Unterschieden bezüglich der Abdeckung führen, die selbst bei den hochsensitiven Methoden von GATC Biotech zu klein sind, um nachgewiesen zu werden.

Wo bekomme ich meine Ergebnisse?

Alle Ergebnisse können über Ihren sicheren Online-Account heruntergeladen werden.

Wie schnell soll ich die Probe nach der Blutentnahme versenden?

Wie empfehlen, dass die Blutprobe innerhalb von 24 Stunden nach der Entnahme an Eurofins Genomics versandt wird. Die Probe muss in Blutentnahmeröhrchen von BCT Streck gelagert werden. Lagerung und Auslieferung von Blutproben müssen bei Raumtemperatur erfolgen. Plasmaproben müssen auf Trockeneis verschickt werden.

Wohin soll ich meine Proben schicken?

Eurofins Genomics Europe Sequencing GmbH
Jakob-Stadler-Platz 7
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Germany

Fragen zu Inview Oncopanel All-In-One

Welche Arten von Proben können mit INVIEW Oncopanel All-In-One verarbeitet werden?

Für INVIEW Oncopanel akzeptieren wir frisch eingefrorene Proben sowie FFPE-Proben (Gewebe und Blut) und genomische DNA.
Für die Flüssigbiopsie-Analyse von aus Blutplasma isolierter zellfreier DNA (cfDNA) sehen Sie sich bitte unser Produkt GATCLiquid Oncopanel All-In-One an.

Wie erfolgt die Anreicherung der gewünschten Genabschnitte?

Die interessierenden Gene werden unter Verwendung firmeneigener Eurofins-Protokolle angereichert. Die Anreicherung der Zielregionen übertrifft die Ergebnisse, die auf der üblichen PCR-basierten Anreicherung erfolgen, dank der gleichmäßigen Abdeckung aller Exone der verschiedenen Gene. Die bewährte Methode zur Anreicherung von Zielregionen wurde von Eurofins optimiert: Mit ihr können hochkomplexe Bibliotheken aus geringsten DNA- Konzentrationen entwickelt werden und sie ergibt eine tiefgreifende und einheitliche Abdeckung. Im Anschluss an die Erfassung der Zielregionen wird eine Next Generation Sequenzierung der Bibliothek durchgeführt.

Welche Arten von Mutationen sind mit INVIEW Oncopanel All-In-One nachweisbar?

Der Service deckt die gesamten Exons von etwa 600 krebsrelevanten Genomregionen vollständig ab, einschließlich proteinkodierender Gene, ausgewählter Promotorregionen, miRNAs, extra-exonische Varianten und ausgewählter Genfusionsereignisse. Neben SNPs und InDels kann das Produkt auch CNVs erkennen.

Wie sensitiv ist das Produkt?

Die Erkennung von SNP und InDel hat eine technische Empfindlichkeit von bis zu 1 %.

Welche Art von Qualitätskontrollen führen Sie durch?

Die Qualität und Quantität jeder Probe werden bei Eingang der Probe oder nach der DNA-Extraktion bestimmt. Weitere Qualitätskontrollen erfolgen bei verschiedenen Schritten des Prozesses.

Was ist der Unterschied zwischen Inview Oncopanel All-In-One und GATCLiquid Oncopanel All-In-One?

Beide Tests bieten Variantenerkennung für Krebserkrankungen auf Basis eines validierten Onkologie-Panels. Die abgesuchten Gene und Genomveränderungen des Panels sind gleich. Ebenso basieren die verwendeten Techniken bei beiden Produkten auf Hybridisierung zur Anreicherung definierter Genabschnitte sowie auf Next Generation Sequenzierung.
Der Unterschied zwischen den beiden Produkten besteht in deren Ausgangsmaterial. Inview Oncopanel All-In-One wird auf herkömmliches Ausgangsmaterial wie z. B. frisch eingefrorene und FFPE-Gewebeproben angewandt, während mit GATCLiquid Oncopanel All-In-One aus Blutplasmaproben extrahierte cfDNA analysiert wird.

Kann ich die Ergebnisse zwischen Inview Oncopanel All-In-One und GATCLiquid Oncopanel All-In-One direkt vergleichen?

Ja, die beiden Dienste eignen sich bestens für Studien, deren Ziel ein Vergleich der Leistungsfähigkeit herkömmlicher Biopsien gegenüber Flüssigbiopsien ist.

Wo liegen die Grenzen der CNV-Analyse?

Auch bei Einreichung zusammengehöriger Proben (Tumorgewebe und Normalgewebe oder Blut vom selben Patienten) kann die gekoppelte Analysemethode Einschränkungen unterliegen. Die Varianz der Messungen an dieser einzelnen zugehörigen Referenzprobe wird höher sein als die einer Referenz, die aus mehreren Referenzproben besteht. Dies könnte zu einer geringen Anzahl von (falsch-positiven) CNV-Identifizierungen führen – auch in Fällen, in denen zwei zusammengehörige Proben tatsächlich die identische Kopienzahl haben.

Werden alle Varianten in meiner Probe erkannt?

Die Heterogenität eines Tumors kann eine korrekte Identifizierung aller relevanten Kopienzahlvariationen in einer gegebenen Probe erschweren. Auch wenn der Tumor selbst homogen ist, kann eine übermäßige Verunreinigung mit normalen Zellen zu Unterschieden bezüglich der Abdeckung führen, die selbst bei den hochsensitiven Methoden von Eurofins Genomics zu klein sind, um nachgewiesen zu werden.

Kann ich Inview Oncopanel All-In-One für diagnostische Zwecke verwenden?

Das Produkt steht nur für Forschungszwecke zur Verfügung. Der Service wird in einem nach ISO17025:2005 akkreditierten und nach ISO13485:2016 zertifizierten Labor durchgeführt. 

Wo erhalte ich meine Ergebnisse und in welcher Form werden sie geliefert? 

Alle Ergebnisse können über Ihr sicheres Online-Account heruntergeladen werden.

Wohin soll ich meine Proben schicken?

Eurofins Genomics Europe Sequencing GmbH
Jakob-Stadler-Platz 7
78467 Konstanz
Germany

Fragen zu Inview Microbiome High Specificity

Welche Art von Proben kann verwendet werden?

Für die Mikrobiom-Analyse kann eine Vielzahl von (DNA-) Proben verwendet werden, wie z. B.:
Aus den verschiedensten Quellen isolierte Umweltproben
Proben menschlichen Ursprungs wie z. B. Abstrich, Stuhl, Lavage
Lebensmittelproben für die Qualitätskontrolle und den Nachweis von Pathogenen im industriellen Umfeld wie z. B. Molkereien, Brauereien, fleischverarbeitenden und landwirtschaftlichen Einrichtungen

Wie viel Ausgangsmaterial wird benötigt?

Informationen über die für spezielle Methoden der Bibliothekerstellung benötigte Menge und Konzentration finden Sie in Ihrem Angebot – oder Sie wenden sich an uns. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, benötigen wir in der Regel > 10 ng aufgereinigte Doppelstrang-DNA für die PCR-Amplifikation (die Gesamtmenge hängt vom Anteil mikrobieller DNA in der Probe ab). Darüber hinaus muss die DNA RNA-frei sein mit einer OD 260/280 von > 1,8 und OD 260/230 von > 1,9

Welche Art von Daten erhalte ich?

Eurofins Genomics liefert Tabellen (TSV, TXT) mit Auflistungen aller in der analysierten Probe vorhandenen Arten und den dazugehörigen Read-Anzahlen Zusätzlich erhalten Sie alle Rohdaten der Sequenzierung.
Operative taxonomische Einheiten (OTUs), klassifiziert durch BLAST-Analyse gegen eine kontrollierte RDP-Datenbank, werden im Tabellenformat einschließlich taxonomischer Klassifikation bis auf Artniveau dargestellt. Bei der OTU-Zuordnung werden nur die besten Treffer berücksichtigt.
Ein Demo-Datenbericht kann hier abgerufen werden.

Warum wird das 16S-rRNA-Gen für die Klassifizierung von Bakterien verwendet?

Das 16S-rRNA-Gen kommt bei allen Bakterien vor. Auf Grund seiner relativ geringen Größe von etwa 1.500 bp und seiner alternierenden Struktur von konservierten und hypervariablen Regionen (V1-V9) ist das 16S rRNA-Gen gut zur Bestimmung und phylogenetischen Analyse von Mikroorganismen geeignet. Mit dem V1-V8-Primerpaar werden ausgezeichnete Ergebnisse erzielt. Das V1-V9-Primerpaar steht ebenfalls zur Verfügung, jedoch raten wir auf Grund der instabilen Primerbindung an die deutlich kleinere V9-Region von seiner Verwendung ab.

Welche Abdeckung ist für die Mikrobiom-Analyse notwendig?

Die tatsächlich erforderliche Sequenziertiefe hängt in erster Linie von der gewünschten Empfindlichkeit und der Komplexität der Probe ab. Die aktuelle Sequenzabdeckung liegt bei etwa 15.000 Reads pro Lauf. Im Zweifelsfall empfehlen wir, die erforderliche Sequenziertiefe anhand eines Versuchs an einer Untergruppe von Proben zu bestimmen. Gleiches gilt für den Versuchsaufbau beim Poolen von bis zu 10 Proben.

Welche Organismen können nachgewiesen werden?

Eine phylogenetische Charakterisierung und Untersuchung von Mikrobengemeinschaften kann für unterschiedliche Organismen aus komplexen und nicht-komplexen Lebensmittel-, Industrie-, Umwelt- und Klinikproben erfolgen. Allerdings können nicht alle Organismen anhand des 16S-rRNA-Gens vollständig aufgeklärt werden. Die Gattung Bacillus ist ein Bakterium, das nicht allein durch 16S-rRNA-Gensequenzierung ausgesondert werden kann. Derartige technische Einschränkungen können wir überwinden – mit unseren ergänzenden Nachweismethoden im Rahmen unserer Dienstleistung für kundenspezifische Lösungen, deren Qualität derjenigen unserer standardisierten Leistungen in nichts nachsteht.

Welches Produkt soll ich wählen – Inview Microbiome Profiling 2.0 mit Illumina oder Fragen zu Inview Microbiome High Specificity mit Pacific Biosciences?

Beide Leistungen profitieren von optimierten PCR-Bedingungen mit einer extrem niedrigen Chimärenbildung.
Durch den 2 x 300 bp Paired-End Read-Modus ist Inview Microbiome Profiling 2.0 gut für die Sequenzierung mehrerer hypervariabler Regionen auf einmal geeignet. Eine skalierbare Sequenzabdeckung erlaubt eine hohe Sequenziertiefe je nach Bedarf. Die Verwendung modernster chemischer Technologie in Form von Illumina bietet ein hohes Maß an Empfindlichkeit und ermöglicht die Erkennung sogar von sehr geringen Mengen von Taxa in einer komplexen Probe. Darüber hinaus kann dank Multiplexen eine große Menge an Proben parallel und innerhalb kurzer Zeit bearbeitet werden.
Inview Microbiome High Specificity mit PacBio ist die Methode der Wahl für die Sequenzierung der gesamten 16S rDNA bei höchstmöglicher taxonomischer Auflösung. Die Sequenzierung langer Amplikons ermöglicht einen hohen Grad an Spezifität bis zum Artniveau. Der „Reads of Insert“-Ansatz erzeugt hochwertige Daten, für die im Voraus der Grenzwert festgelegt werden kann. Dank des hohen Grades an Empfindlichkeit der vollständigen 16S-Analyse mit SMRT-Sequenzierungstechnologie ist eine Charakterisierung der Mikrobengemeinschaft sogar bei niedrigen Dichten möglich.

Wohin soll ich meine Proben schicken?

Eurofins Genomics Europe Sequencing GmbH
Jakob-Stadler-Platz 7
78467 Konstanz
Germany

Fragen zu Inview Metagenome Advance

Welche Art von Proben kann verwendet werden?

Für INVIEW METAGENOME ADVANCE akzeptieren wir aus der klinischen Forschung stammende Proben menschlichen Ursprungs (z. B. Abstriche, Faeces, Lavage). Auf Anfrage können für die Analyse des gesamten Metagenoms viele Arten von Ausgangsmaterialien verwendet werden, wie z. B.:

Lebensmittelproben für die Qualitätskontrolle und Nachweis von Pathogenen im industriellen Umfeld (Molkereien, Brauereien, fleischverarbeitende und landwirtschaftliche Einrichtungen)
Umweltproben
Eurofins Genomics hat besonders viel Erfahrung mit der DNA-Isolierung und Sequenzierung von Stuhlproben.

Wieviel Ausgangsmaterial wird benötigt?

Spezifische Informationen über die für spezielle Methoden der Bibliothekerstellung benötigte Menge und Konzentration finden Sie in Ihrem Angebot – oder Sie wenden sich direkt an uns. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, benötigen wir in der Regel > 100 ng aufgereinigte Doppelstrang-DNA (die Gesamtmenge hängt vom Anteil mikrobieller DNA in der Probe ab). Bitte beachten Sie, dass die DNA RNA-frei sein und eine OD 260/280 von > 1,8 und OD 260/230 von > 2,0 haben muss.

Welche Art von Daten erhalte ich?

Eurofins Genomics liefert Tabellen (TSV, TXT) mit Auflistungen aller in Ihrer Probe vorhandenen Gattungen und den jeweiligen Read-Anzahlen. Zusätzlich erhalten Sie alle Rohdaten der Sequenzierung.

Operationale taxonomischen Einheiten (OTUs), klassifiziert vom Kraken‘schen exakten k-mer-Alignmentalgorithmus und der entsprechenden MiniKrakenDB-Datenbank, werden in Tabellenform mit taxonomischer Identifizierung dargestellt.

Welche Abdeckung ist für die Metagenom-Analyse notwendig?

Die für die Metagenom-Sequenzierung erforderliche Sequenzierungstiefe richtet sich vor allem nach der Komplexität der Probe (der Anzahl und Repräsentation der einzelnen Spezies) sowie nach dem Grad der erwarteten Wirtskontamination. Mikrobengemeinschaften hoher Komplexität mit hohen Hintergrundwerten an Wirts-DNA erfordern mehr Abdeckung als Proben geringerer Komplexität und mit einem geringeren Grad an Wirts-DNA-Kontamination. Im Zweifelsfall empfehlen wir, die erforderliche Sequenzabdeckung anhand eines Pilotversuchs an einer Untergruppe von Proben zu bestimmen.

Garantieren Sie einen bestimmten Output für die Sequenzierung?

Ja, Inview Metagenome Advance beinhaltet eine Garantie für 10 Millionen Read-Paare. Weitere Read-Pakete können separat bestellt werden.

Welche Organismen können nachgewiesen werden?

Die Metagenomanalyse ermöglicht die Identifizierung von Mikroorganismen unabhängig von taxonomischen Markern wie z. B. 16S rRNA. Anhand der Metagenomsequenzierung können sowohl kultivierbare als auch nicht-kultivierbare Organismen wie z. B. Bakterien, Archaeen, Pilze, Protozoen und Viren identifiziert werden. Zwar hat Eurofins Genomics am meisten Erfahrung mit der Profilierung der humanen Mikrobiota, wir charakterisieren jedoch auch mit Erfolg Elemente aus Mikrobengemeinschaften aus Lebensmittel-, Industrie und Umweltproben.

Welchen Service soll ich wählen – die gezielte Amplikon-Sequenzierung oder Metagenom-Sequenzierung?

Sowohl Amplikon- als auch Metagenom-Sequenzierung weisen klare Vorteile sowie auch Nachteile auf. Ihre Methode der Wahl sollte sich nach Ihrem Forschungsziel richten. Der Erfolg eines Projekts hängt in der Regel von mehreren Faktoren ab, wie z. B. von der Zusammensetzung der Gemeinschaft, der Häufigkeit eng verwandter Arten und der Sequenzierungstiefe.

Amplikon-Sequenzierung bietet eine zweckmäßige taxonomische Profilerstellung einer großen Anzahl von Proben. Dieser Ansatz ermöglicht die Erkennung von feinen Unterschieden zwischen Mikrobengemeinschaften; daher ist die Methode für statistische Vergleiche vorteilhaft, wie z. B. für Fall-Kontroll-Studien oder für Probenahmen aus unterschiedlichen Umgebungen im Lauf der Zeit.

Metagenom-Sequenzierung ist nicht auf einen bestimmten Satz von Primern angewiesen, wodurch die Methode frei ist von taxon-spezifischem PCR-Bias. Dadurch sind präzisere Darstellungen der analysierten Mikrobiota und zuverlässigere Schätzungen von Artenhäufigkeiten möglich. Die Metagenomanalyse kann Informationen sowohl über die taxonomischen als auch die funktionellen Eigenschaften einer bestimmten Probe liefern.

Was ist der Unterschied zwischen Inview Metagenome Explore und Inview Metagenome Advance?

Inview Metagenome Explore ist ideal geeignet für eine breit angelegte taxonomische Profilierung aller in einem bestimmten Mikrobiom vorhandenen Organismen. Die inbegriffenen 10 Millionen Read-Paare eignen sich zur Analyse von Metagenomen geringer Komplexität sowie auch für eine umfassende Übersicht über Gattungen in komplexen Metagenomen. Eine tiefere Sequenzabdeckung kann anhand von zusätzlichen Read-Paketen erreicht werden.

Inview Metagenome Advance bietet zusätzlich zur taxonomischen Charakterisierung eine detaillierte Beurteilung von Antibiotikaresistenzen und der Funktion in der Gemeinschaft. Das Produkt ist ideal für die Profilerstellung komplexer Metagenome. Für eine tiefere Sequenzabdeckung als die inbegriffenen 10 Millionen Read-Paare können zusätzliche Read-Pakete hinzugefügt werden. Der Service kann auf die Quantifizierung funktioneller Prozesse in einer speziellen Gemeinschaft oder auf die Erkennung zahlreicher Resistenzfaktoren in einer ungestörten natürlichen Umgebung angewendet werden. Bitte beachten Sie, dass die erforderliche Sequenziertiefe für eine erfolgreiche Metagenomprofilierung stark von der Komplexität und dem erwarteten Grad an Wirtskontamination des Ausgangsmaterials beeinflusst wird. Daher ist möglicherweise ein zusätzlicher Sequenzier-Aufwand erforderlich, um zufriedenstellende Ergebnisse zu erzielen.

Wohin soll ich meine Proben schicken?

Eurofins Genomics Europe Sequencing GmbH
Jakob-Stadler-Platz 7
78467 Konstanz
Germany

Fragen zu Inview Metagenome Explore

Welche Art von Proben kann verwendet werden?

Generell können alle Arten von (DNA-) Proben für die Metagenom-Profilierung verwendet werden, wie z. B.:

  • Proben menschlichen Ursprungs (Abstrich, Stuhl, Lavage)
  • Lebensmittelproben für die Qualitätskontrolle bzgl. Mikroorganismen und den Nachweis von Pathogenen im industriellen Umfeld (Molkereien, Brauereien, fleischverarbeitende und landwirtschaftliche Einrichtungen)
  • Umweltproben

Eurofins Genomics hat besonders viel Erfahrung mit der DNA-Isolierung und Sequenzierung von Stuhlproben

Wieviel Ausgangsmaterial wird benötigt?

Informationen über die für spezielle Methoden der Bibliothekerstellung benötigte Menge und Konzentration finden Sie in Ihrem Angebot – oder Sie wenden sich an uns. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, benötigen wir in der Regel > 100 ng aufgereinigte Doppelstrang-DNA (die Gesamtmenge hängt vom Anteil mikrobieller DNA in der Probe ab). Bitte beachten Sie, dass die DNA RNA-frei sein und eine OD 260/280 von > 1,8 und OD 260/230 von > 2,0 haben muss.

Welche Art von Daten erhalte ich?

Eurofins Genomics liefert Tabellen (TSV, TXT) mit Auflistungen aller in der analysierten Probe vorhandenen Gattungen und den jeweiligen Read-Anzahlen. Zusätzlich erhalten Sie alle Rohdaten der Sequenzierung.

Operative taxonomische Einheiten (OTUs), klassifiziert durch BLAST-Analyse gegen geeignete Datenbanken, werden in tabellarischer Form einschließlich taxonomischer Identifizierung dargestellt. Für die OTU-Zuordnung werden nur die besten Treffer berücksichtigt.

Welche Abdeckung ist für die Metagenom-Analyse notwendig?

Die für die Metagenom-Sequenzierung erforderliche Sequenzierungstiefe richtet sich vor allem nach der Komplexität der Probe (der Anzahl und Repräsentation der einzelnen Spezies) sowie nach dem Grad der erwarteten Wirtskontamination. Proben hoher Komplexität mit hohen Hintergrundwerten an Wirts-DNA erfordern mehr Abdeckung als Proben geringerer Komplexität und mit einem geringeren Grad an Wirts-DNA-Kontamination. Im Zweifelsfall empfehlen wir, die erforderliche Sequenzabdeckung anhand eines Pilotversuchs an einer Untergruppe von Proben zu bestimmen.

Garantieren Sie eine bestimmten Output für die Sequenzierung?

Ja, INVIEW METAGENOME EXPLORE beinhaltet eine Garantie für 10 Millionen Read-Paare. Weitere Read-Pakete können separat bestellt werden.

Welche Organismen können nachgewiesen werden?

Die Metagenomanalyse ermöglicht die Identifizierung von Mikroorganismen unabhängig von taxonomischen genetischen Markern. Die Methode ermöglicht die Identifizierung kultivierbarer und nicht-kultivierbarer Organismen, wie z. B. Bakterien, Archaeen und Viren, sowie einfacher Eukaryoten einschließlich Pilzen und Protisten. Zwar hat Eurofins Genomics am meisten Erfahrung mit der Profilierung der humanen Mikrobiota, wir identifizieren jedoch auch mit Erfolg Elemente aus Mikrobengemeinschaften in Lebensmittel-, Industrie und Umweltproben.

Welchen Service soll ich wählen – die gezielte Amplikon-Sequenzierung oder Metagenom-Sequenzierung?

Sowohl Amplikon- als auch Metagenom-Sequenzierung haben jeweils Vorteile und Nachteile.

Ihre Methode der Wahl sollte sich nach Ihrem Forschungsziel richten. Der Erfolg eines Projekts hängt ganz allgemein von mehreren Faktoren ab, wie z. B. von der Zusammensetzung der Gemeinschaft, der Häufigkeit eng verwandter Arten oder Stämme und der Tiefe der Sequenzierungsabdeckung.

Amplikon-Sequenzierung bietet eine zweckmäßige Beurteilung der taxonomischen Zusammensetzung und Vielfalt einer großen Anzahl von Proben. Da man bessere Möglichkeiten hat, feine Unterschiede zwischen Mikrobengemeinschaften zu erkennen, ist die Methode für statistische Vergleiche vorteilhaft, wie z. B. für Fall-Kontroll-Studien oder für Probenahmen aus unterschiedlichen Umgebungen im Lauf der Zeit.

Metagenom-Sequenzierung ist aufgrund der verwendeten Zusammenstellung an Primern frei von taxonspezifischem PCR-Bias. Dies ermöglicht präzisere Darstellungen der analysierten Mikrobiota und zuverlässigere Schätzungen von Artenhäufigkeiten. Darüber hinaus können anhand der Metagenomanalyse sowohl taxonomische als auch funktionelle Eigenschaften einer bestimmten Probe aufgeklärt werden.

Was ist der Unterschied zwischen Inview Metagenome Explore und Inview Metagenome Advance?

Inview Metagenome Explore ist das ideale Produkt für die allgemeine taxonomische Profilierung aller in einem bestimmten Mikrobiom vorhandenen Organismen. Die inbegriffenen 10 Millionen Read-Paare eignen sich zur Analyse von Metagenomen geringer Komplexität sowie auch für eine umfassende Übersicht über Gattungen in komplexen Metagenomen. Eine tiefere Sequenzabdeckung kann anhand von zusätzlichen Read-Paketen erreicht werden.

Inview Metagenome Advance bietet zusätzlich zur taxonomischen Charakterisierung eine detaillierte Beurteilung von Antibiotikaresistenzen und der Funktion in der Gemeinschaft. Das Produkt ist ideal für die Profilerstellung komplexer Metagenome. Für eine tiefere Sequenzabdeckung als die inbegriffenen 10 Millionen Read-Paare können zusätzliche Read-Pakete hinzugefügt werden. Der Service unterstützt bei der Quantifizierung funktioneller Prozesse in einer speziellen Gemeinschaft oder bei der Erkennung zahlreicher Resistenzfaktoren in einer ungestörten natürlichen Umgebung.

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Fragen zu Inview Transcriptome Discover

Welches Inview Transcriptome-Paket empfehlen Sie für welchen Anwendungsbereich?

Dies hängt von vielen Faktoren ab, wie u. a. von der Art der Gewebes, der Probenqualität, dem Entwicklungsstadium, den vorhandenen Sequenzen usw.. Entnehmen Sie bitte der Tabelle unter „Produktspezifikationen“ Ihre optimale Inview Transcriptome-Lösung. Die dort angegebenen geschätzten Read-Anzahlen beziehen sich auf humane Proben. Alternativ können Sie uns kontaktieren, um Ihr Projekt mit uns zu besprechen. In bestimmten Fällen ist es möglicherweise ratsam, mit Hilfe eines Testlaufs zu ermitteln, wie viele Reads für Ihren speziellen Zweck oder Organismus benötigt werden.
 
Das Paket Inview Transcriptome Explore gibt Ihnen einen Überblick über die exprimierten Gene und eignet sich gut zum Erkennen von Unterschieden zwischen den Proben.  
 
Inview Transcriptome Disciver verwendet eine strangspezifische RNA-Library kombiniert mit 150 bp Paired-End-Sequenzierung von Illumina. Somit empfiehlt sich das Paket für die Erkennung von differenziell exprimierten Genen, seltenen und neuen Transkripten sowie für die Entdeckung von Spleißvarianten. Darüber hinaus ermöglichen die Informationen über die Orientierung des Transkripts eine präzisere Bestimmung von Struktur und Genexpression.  

Brauche ich eine genomische Referenzsequenz?

Nicht unbedingt. Sollten Sie jedoch eine Referenz haben, nehmen Sie bitte die folgenden Empfehlungen zur Kenntnis. Ein klar definierter Ensembl-Name (z. B. GRCh37 oder Rnor_5.0) für die annotierte genomische Referenzsequenz muss vor Projektbeginn zur Verfügung gestellt werden. Alternativ kann die Genomsequenz in Fasta bereitgestellt werden (zusammen mit der entsprechenden Annotation im Gene Transfer Format (GTF) oder im GenBank-Format, einschließlich Annotation). Projekte ohne Referenzgenom können mit De novo-Transkriptom-Sequenzierung basierend auf der Technologie von PacBio RS II ergänzt werden.

Welche Ausgangsmaterialien werden akzeptiert?

Zur Erstellung von Libraries für die Sequenzierung kann Gesamt-RNA aus Gewebe, Zellen oder Körperflüssigkeiten von eukaryotischen oder prokaryotischen Organismen verwendet werden. Zusätzlich zu aus frischem Gewebe isolierter RNA kann auch RNA aus FFPE-Proben analysiert werden. RNA-Isolation kann als Zusatzleistung angeboten werden. Bei Fragen zu Ausgangsmaterial aus anderen Quellen sprechen Sie uns bitte an.

Wieviel Ausgangsmaterial wird benötigt?

Informationen über die für spezielle Methoden der Library-Erstellung benötigte RNA-Menge und -Konzentration finden Sie in Ihrem Angebot – oder Sie wenden sich an uns. In der Regel benötigen wir für optimale Ergebnisse 150 ng hochwertige RNA (bis zu 25 μl / optimale Konzentration 6 - 50 ng / μl (maximale Konzentration 200 ng / μl) mit einer OD 260/280 von 1,8 – 2,0 und einer OD 260/230 von 2,0 – 2,2. Möglicherweise kann mit weniger Material begonnen werden, doch dies hängt in hohem Maß von der Qualität des Materials und der gewünschten Library ab.
Die Qualität und Quantität des bereitgestellten Ausgangsmaterials sind für den Erfolg der Probenvorbereitung entscheidend. Bei Verwendung von zu wenig oder degradiertem, kontaminiertem oder anderweitig geschädigtem Ausgangsmaterial kann die Folge ein sehr niedriger Ertrag, eine fehlgeschlagene Probenvorbereitung sowie eine beeinträchtigte Qualität und Quantität der Sequenzierungsergebnisse sein.

Kann eine RNA-Isolation angeboten werden?

Eurofins Genomics bietet RNA-Isolation als Zusatzleistung an. Wir haben die Protokolle zur Extraktion von qualitativ hochwertiger RNA aus mehreren Probenarten und Ausgangsmaterialien erfolgreich optimiert. Weitere Informationen zur RNA-Isolation finden Sie in den Produktspezifikationen – oder lassen Sie sich von uns direkt beraten: Wir besprechen mit Ihnen mögliche Methoden der Probenvorbereitung für Ihre individuellen Anforderungen.

Welche Ausgangsmaterialien und Ziele sind zur Durchführung der rRNA-Abreicherung am besten geeignet?

a) Für Eukaryoten: Eine rRNA-Abreicherung empfiehlt sich für teilweise degradierte RNA oder bei Sequenzierung der RNA ohne Poly-A-Schwanz. b) Für Prokaryoten empfehlen wir generell eine rRNA-Abreicherung, da eine poly-(A)-Anreicherung von prokaryotischen Transkripten nicht durchführbar ist.
Eine rRNA-Abreicherung kann bei GATC Biotech angefordert werden. Alternativ können Sie uns eine bereits rRNA-abgereicherte/mRNA-angereicherte RNA als Ausgangsmaterial zur Verfügung stellen (20 ng pro Probe (bis zu 15 µl / Konzentration >1,4 ng/µl)). Weitere Informationen finden Sie in den Produktspezifikationen

Wie effizient ist die rRNA-Abreicherung?

Die Effizienz der RNA-Entfernung richtet sich nach dem Organismus, der Zusammensetzung und der Qualität Ihrer Proben-RNA. Bei stark degradierter RNA kann eine Ribo-Abreicherung weniger effizient sein.

Soll ich mein Ausgangsmaterial auf Trockeneis verschicken oder ist Raumtemperatur ausreichend?

RNA muss auf Trockeneis versandt werden, sofern sie nicht mit Ethanol ausgefällt wurde. Gewebe/Zellkulturen müssen in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis schockgefroren und auf Trockeneis versandt werden. Alternativ kann frisches Material in „RNAlater“ (z. B. von Ambion, SIGMA oder QIAGEN) stabilisiert und bei Raumtemperatur versandt werden. Bitte prüfen Sie im Voraus, ob der von Ihnen beauftragte Kurier Trockeneisversand anbietet.

Was soll ich tun, wenn meine Probe die Eingangs-QC nicht besteht?

Sollten die Menge, Konzentration oder Qualität des Ausgangsmaterials die Voraussetzungen für die Weiterverarbeitung nicht erfüllen, werden wir Sie kontaktieren und mit ihnen das weitere Vorgehen besprechen. Sofern möglich, wird Eurofins Genomics dann zusätzliche Vorverarbeitungsschritte zur Optimierung der Probenqualität empfehlen.

Wo und in welcher Form erhalte ich meine Ergebnisse?

Alle Rohdaten sowie die analysierten Daten können über Ihr sicheres Online-Konto heruntergeladen werden.

Welche Art von BioIT bieten Sie an?

Eine kostengünstige, hochwertige bioinformatische Analyse einschließlich Datenfilterung und QK ist optional für jedes Paket erhältlich.

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Fragen zu Inview Transcriptome Explore

Welches Inview Transcriptome-Paket empfehlen Sie für welchen Anwendungsbereich?

Dies hängt von vielen Faktoren ab, wie u. a. von der Art der Gewebes, der Probenqualität, dem Entwicklungsstadium, den vorhandenen Sequenzen usw. Entnehmen Sie bitte der Tabelle unter „Produktspezifikationen“ Ihre optimale INVIEW TRANSCRIPTOME-Lösung. Die dort angegebenen geschätzten Read-Anzahlen beziehen sich auf humane Proben. Alternativ können Sie uns kontaktieren, um Ihr Projekt mit uns zu besprechen. In bestimmten Fällen ist es möglicherweise ratsam, mit Hilfe eines Testlaufs zu ermitteln, wie viele Reads für Ihren speziellen Zweck oder Organismus benötigt werden.
 
Das Paket Inview Transcriptome Explore gibt Ihnen einen Überblick über die exprimierten Gene und ist ideal zum Erkennen von Unterschieden zwischen Bedingungen oder Experimenten.  
 
Inview Transcriptome Discover verwendet eine strangspezifische RNA-Library kombiniert mit 125 bp Paired-End-Sequenzierung. Somit empfiehlt sich das Paket für die Erkennung von differenziell exprimierten Genen, seltenen und neuen Transkripten sowie für die Entdeckung von Spleißvarianten. Darüber hinaus erlauben die Informationen über die Orientierung des Transkripts eine noch tiefergehende Bestimmung von Genstruktur und Genexpression.  

Brauche ich eine genomische Referenzsequenz?

Ein klar definierter Ensembl-Name (z. B. GRCh37 oder Rnor_5.0) für die annotierte genomische Referenzsequenz muss vor Projektbeginn zur Verfügung gestellt werden. Alternativ kann die Genomsequenz in Fasta bereitgestellt werden (zusammen mit der entsprechenden Annotation im Gene Transfer Format (GTF) oder im GenBank-Format (einschließlich Annotation)). Projekte ohne Referenzgenom können mit De novo-Transkriptom-Sequenzierung, basierend auf der Technologie von PacBio, ergänzt werden.

Welche Ausgangsmaterialien werden akzeptiert?

Gesamt-RNA aus Gewebe, Zellen oder Körperflüssigkeiten von eukaryotischen oder prokaryotischen Organismen wird für die Präparation einer Sequenzier-Library akzeptiert. Zusätzlich zu RNA aus frischem Gewebe kann auch RNA aus FFPE-Proben analysiert werden. Die RNA-Isolation wird als optionale Zusatzleistung angeboten. Bei Fragen zu Ausgangsmaterialien aus anderen Quellen sprechen Sie uns bitte an.

Wieviel Ausgangsmaterial wird benötigt?

Informationen über die für spezielle Methoden der Library-Erstellung benötigte RNA-Menge und -konzentration finden Sie in Ihrem Angebot – oder Sie wenden sich an uns. In der Regel benötigen wir für optimale Ergebnisse 150 ng hochwertige RNA (bis zu 25 µl / optimale Konzentration 6 - 50 ng / µl (maximale Konzentration 200 ng / µl) mit einer OD 260/280 von 1,8 – 2,0 und einer OD 260/230 von 2,0 – 2,2. Möglicherweise kann mit weniger Material begonnen werden, doch dies hängt in hohem Maß von der Qualität des Materials und der gewünschten Library ab. 
Die Qualität und Quantität des bereitgestellten Ausgangsmaterials sind für den Erfolg der Probenvorbereitung entscheidend. Bei Verwendung von zu wenig oder degradiertem, kontaminiertem oder anderweitig geschädigtem Ausgangsmaterial kann die Folge eine sehr geringe Ausbeute, eine fehlgeschlagene Probenvorbereitung sowie eine beeinträchtigte Qualität und Quantität der Sequenzierungsergebnisse sein.

Wird eine RNA-Isolation angeboten?

GATC Biotech kann RNA-Isolation als Zusatzleistung anbieten. Wir haben verschiedene Protokolle zur Isolation von qualitativ hochwertiger RNA aus mehreren Probenarten und Quellen erfolgreich getestet und optimiert. Weitere Informationen zur RNA-Isolation finden Sie in den Produktspezifikationen – oder lassen Sie sich von uns direkt beraten: Wir besprechen mit Ihnen mögliche Methoden der Probenvorbereitung für Ihre individuellen Anforderungen und Projektziele.

Welche Ausgangsmaterialien und Ziele sind zur Durchführung der rRNA-Abreicherung am besten geeignet?

a) Für Eukaryoten: Eine rRNA-Abreicherung empfiehlt sich für (teilweise) degradierte RNA oder bei Sequenzierung der RNA ohne Poly-A-Schwanz. b) Für Prokaryoten empfehlen wir generell eine rRNA-Abreicherung, da eine poly-(A)-Anreicherung von prokaryotischen Transkripten nicht durchführbar ist.
Eine rRNA-Abreicherung kann bei GATC Biotech angefordert werden. Alternativ können Sie uns eine bereits rRNA-abgereicherte/mRNA-angereicherte RNA als Ausgangsmaterial zur Verfügung stellen (20 ng pro Probe (bis zu 15 µl / Konzentration >1,4 ng/µl)). Weitere Informationen finden Sie in den Produktspezifikationen.

Wie effizient ist die rRNA-Abreicherung?

Die Effizienz der RNA-Entfernung richtet sich nach dem Organismus und der Zusammensetzung und Qualität Ihrer Proben-RNA. Bei stark degradierter RNA kann eine Ribo-Abreicherung weniger effizient sein.

Soll ich mein Ausgangsmaterial auf Trockeneis verschicken oder ist Raumtemperatur ausreichend?

RNA muss auf Trockeneis versandt werden, sofern sie nicht mit Ethanol ausgefällt wurde. Gewebe/Zellkulturen müssen in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis schockgefroren und auf Trockeneis versandt werden. Alternativ kann frisches Material in „RNAlater“ (z. B. von Ambion, SIGMA oder QIAGEN) stabilisiert und bei Raumtemperatur versandt werden. Bitte prüfen Sie im Voraus, ob der von Ihnen beauftragte Kurier Trockeneisversand anbietet.

Was soll ich tun, wenn meine Probe die Eingangs-QK nicht besteht?

Sollten die Menge, Konzentration und/oder Qualität des Ausgangsmaterials die Voraussetzungen für die Weiterverarbeitung nicht erfüllen, werden wir Sie kontaktieren und mit ihnen das weitere Vorgehen besprechen. Sofern möglich, wird Eurofins Genomics dann zusätzliche Vorverarbeitungsschritte zur Optimierung der Probenqualität empfehlen.

Wo und in welcher Form erhalte ich meine Ergebnisse?

Alle Rohdaten sowie die analysierten Daten können über Ihr sicheres Online-Konto heruntergeladen werden.

Welche Art von BioIT bieten Sie an? Haben Sie Demo-Daten?

Eine kostengünstige, hochwertige bioinformatische Analyse einschließlich Datenfilterung und QK ist optional für jedes Paket erhältlich. Weitere Details siehe „Dateien“ auf dieser Website.

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Fragen zu Inview Transcriptome Isoform Discover

Wie unterscheidet sich Inview Transcriptome Isoform Discover von Inview Transcriptome Explore, Advance und Discover?

Inview Transcriptome Isoform Discover ist ein standardisierter RNA-Sequenzierdienst, der mittels SMRT®-Technologie von PacBio vollständige cDNA-Transkripte charakterisiert. Das Produkt eignet sich hervorragend für die eingehende Erforschung der Isoformenvielfalt und zum Erstellen eines vollständigen Profils alternativer Spleißereignisse bei Eukaryoten.
Inview Transcriptome Explore, Advance und Discover sind standardisierte Produkte, die mit Hilfe der Plattformen von Illumina eine Vielzahl von Bibliothekstypen sequenzieren sowie Untersuchungen zur Genexpression, Genregulation und Identifizierung seltener oder neuartiger RNA-Spezies ermöglichen. Die Produkte sind auf jeden interessierenden Organismus anwendbar und erlauben die Analyse von kodierender und nichtkodierender RNA.

Welches Ausgangsmaterial wird akzeptiert?

Gesamt-RNA von eukaryotischen Organismen kann zur Erstellung von vollständigen cDNA-Sequenzierungsbibliotheken verwendet werden.

Wieviel Ausgangsmaterial wird benötigt?

Genaue Informationen über die benötigte RNA-Menge und -Konzentration finden Sie in Ihrem Angebot – oder Sie wenden sich direkt an uns. In der Regel benötigen wir für optimale Ergebnisse 3 µg hochwertige RNA mit einer OD 260/280 von 1,8 – 2,2.
Die Qualität und Quantität des bereitgestellten Ausgangsmaterials sind für den Erfolg der Probenvorbereitung entscheidend. Bei Verwendung von zu wenig oder degradiertem oder kontaminiertem Ausgangsmaterial kann die Folge ein sehr niedriger Ertrag, eine fehlgeschlagene Probenvorbereitung sowie eine beeinträchtigte Qualität und Quantität der Sequenzierungsergebnisse sein.

Wie viele Datenpaketen brauche ich, um mein Versuchsziel zu erreichen?

ISOFORM DISCOVER - recommended number of packages

Bietet Eurofins Genomics RNA-Isolierung an?

Eurofins Genomics kann eine auf optimierten Protokollen basierende RNA-Isolation als Zusatzleistung anbieten. Gerne besprechen wir mit Ihnen mögliche Methoden der Probenvorbereitung für Ihre individuellen Projektanforderungen – lassen Sie sich von uns beraten!

Soll ich mein Ausgangsmaterial auf Trockeneis verschicken oder ist Raumtemperatur ausreichend?

RNA muss auf Trockeneis versandt werden, sofern sie nicht mit Ethanol ausgefällt wurde. Gewebe/Zellkulturen müssen in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis schockgefroren und auf Trockeneis versandt werden. Alternativ kann frisches Material in „RNAlater“ (von Firmen wie z. B. Ambion, SIGMA oder QIAGEN) stabilisiert und bei Raumtemperatur versandt werden. Bitte prüfen Sie im Voraus, ob der von Ihnen beauftragte Kurier Trockeneisversand anbietet.

Was soll ich tun, wenn meine Probe die Eingangs-QK nicht besteht?

Sollten die Menge oder Qualität des Ausgangsmaterials die Voraussetzungen für die Weiterverarbeitung nicht erfüllen, werden wir Sie sofort kontaktieren und mit ihnen das weitere Vorgehen besprechen. Sofern möglich, wird Eurofins Genomics dann zusätzliche Verarbeitungsschritte zur Verbesserung der Probenqualität empfehlen.

Wie erhalte ich meine Ergebnisse und in welcher Form werden sie geliefert?

Alle Rohdaten sowie die analysierten Daten in verschiedenen Formaten können über Ihr sicheres Online-Konto heruntergeladen werden.

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Fragen zu NGSelect Amplicon

Welches Ausgangsmaterial wird akzeptiert?

Eine Liste der akzeptierten Ausgangsmaterialien einschließlich der jeweiligen Mengen finden Sie in Tabelle 1 unter Produktspezifikationen.

Welche Art von Qualitätskontrolle führen Sie durch?

NGSelect Amplicon Adaptor Ligation:

Vor der Sequenzierung werden Qualität und Quantität jeder Probe anhand von etablierten Methoden bestimmt (z. B. Agarosegel-Analyse / Qubit® Fluorometer / NanoDrop / Agilent 2100 Bioanalyzer). Weitere Qualitätskontrollen erfolgen bei verschiedenen Schritten des Sequenzierungsablaufs.

 

NGSelect Amplicon 2nd PCR:

Neben der Evaluation des Gelbildes, das Sie senden, dient der Erfolg der PCR-Reaktion als Qualitätskontrolle. Im Anschluss an die PCR, und an weiteren Schritten des Sequenzierungsablaufs werden weitere Qualitätskontrollen durchgeführt.

Was soll ich tun, wenn meine Probe die Eingangs-QK nicht besteht?

NGSelect Amplicon Adaptor Ligation:

Sollten die Menge, Konzentration oder Qualität des Ausgangsmaterials die Voraussetzungen für die Weiterverarbeitung nicht erfüllen, wird unser Kundenbetreuungsteam Sie kontaktieren und mit ihnen das weitere Vorgehen für Ihr Projekt besprechen. Eurofins Genomics wird Ihnen nach Möglichkeit zusätzliche Maßnahmen zur Optimierung der Probenqualität empfehlen.

NGSelect Amplicon 2nd PCR:

Für den Fall, dass die 2. PCR nicht zu einem Amplikon führt und wir eine Wiederholung aufgrund unserer Erfahrungen als vielversprechend einstufen, wird Eurofins Genomics die Amplikonengeneration einmalig wiederholen. Falls die Wiederholung nicht erfolgreich ist, wird Eurofins Genomics die Bearbeitung der relevanten Proben stoppen und Ihnen den Sequenzierungsteil erstatten, der nicht durchgeführt wurde. Für den Fall, dass nur ein schwaches Amplicon generiert werden kann, wird Eurofins Genomics diese Amplikons auch für die Sequenzierung in den Amplikonpool aufnehmen. Die Erfahrung zeigt, dass diese Amplikons nur sehr wenige Reads generieren wird und deren Interpretation mit besonderer Sorgfalt erfolgen sollte.

Welche Art von BioIT bieten Sie an?

Eine kostengünstige, hochwertige bioinformatische Analyse ist für jedes Paket erhältlich (weitere Informationen siehe „Produktspezifikationen“).

Kann ich die Ergebnisse für diagnostische Zwecke verwenden?

Ja. Auf Wunsch kann der Service unter diagnostischen Bedingungen mit ISO 17025-zertifizierten Prozessen durchgeführt werden.

Wo erhalte ich meine Ergebnisse und in welcher Form werden sie geliefert?

Für das Produkt NGSelect Amplicon 2nd PCR können Sie die Ergebnisse von unserem sicheren FTP Server herunterladen (passwort wird Ihnen mitgeteilt). Für das Produkt NGSelect Amplicon Adaptor Ligation stellen wir Ihnen die Ergebnisse über Ihren Ecom Account zu Verfügung.

Wie wähle ich aus den verschiedenen NGSelect-Diensten den richtigen aus?

NGSelect gliedert sich in vier Hauptkategorien, die von Ausgangsmaterial, DNA, RNA, Amplikons oder Ready-to-Load-Bibliotheken abhängig sind. Jeder dieser Dienste bietet eine Vielzahl von Optionen, mit denen individuelle und erschwingliche NGS-Projekte entworfen werden können. Weitere Informationen finden Sie in Tabelle 2 (nachstehend):

Überblick über die verschiedenen Dienstleistung bei NGSELECT

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Können wir für das Produkt NGSelect Amplicon 2nd PCR Amplikonproben einschicken, die aus mehreren verschiedenen Amplikons, generiert mit verschiedenen Primerpaaren bestehen?

Normalerweise würden Sie pro Probe 1 Amplikon senden, das mit 1 Primerpaar erzeugt wurde.

In einigen Fällen können jedoch weniger Reads pro Amplikon erforderlich sein, wie in der Projektspezifikation angegeben. In solchen Fällen können die einzelnen Amplikonproben, die Sie senden, auch aus mehreren Amplikons bestehen, die mit verschiedenen Primerpaaren generiert wurden. In diesem Fall werden wir jedoch keine Primersequenzen clippen und Rohdaten liefern.

Fragen zu NGSelect DNA

Welches Ausgangsmaterial wird akzeptiert?

Eine Liste der akzeptierten Ausgangsmaterialien einschließlich der jeweiligen Mengen finden Sie in Tabelle 1 unter Produktspezifikationen.

Brauche ich immer eine genomische Referenzsequenz?

Nein, für die De novo-Genomsequenzierung auf der PacBio-Plattform ist keine Referenzsequenz erforderlich. In anderen Fällen muss vor Projektbeginn ein klar definierter Ensembl-Name für die annotierte genomische Referenzsequenz zur Verfügung gestellt werden. Alternativ kann die Genomsequenz im Fasta-Format (zusammen mit der entsprechenden Annotation im Gene Transfer Format (GTF)) oder im GenBank-Format (einschließlich Annotation) bereitgestellt werden.

Welche Art von Qualitätskontrolle führen Sie durch?

Qualität und Quantität jeder eingehenden Probe werden mit entsprechenden Methoden bestimmt (z. B. Agarosegel-Analyse / Qubit® Fluorometer / NanoDrop / Agilent 2100 Bioanalyzer). Weitere Qualitätskontrollen erfolgen bei verschiedenen Schritten des Prozesses.

Was soll ich tun, wenn meine Probe die Eingangs-QK nicht besteht?

Sollten die Menge, Konzentration und/oder Qualität des Ausgangsmaterials die Voraussetzungen für die Weiterverarbeitung nicht erfüllen, werden wir Sie kontaktieren und mit ihnen das weitere Vorgehen besprechen. Sofern möglich, wird Eurofins Genomics dann zusätzliche Vorverarbeitungsschritte zur Optimierung der Probenqualität empfehlen.

Welche Art von BioIT bieten Sie an?

Eine kostengünstige, hochwertige bioinformatische Analyse einschließlich Datenfilterung und QK ist für jedes Paket erhältlich.

Kann ich die Ergebnisse für diagnostische Zwecke verwenden?

Ja, auf Wunsch kann der Service unter diagnostischen Bedingungen mit ISO 17025-zertifizierten Arbeitsabläufen durchgeführt werden.

Wo erhalte ich meine Ergebnisse und in welcher Form werden sie geliefert?

Alle Rohdaten sowie die analysierten Daten können über Ihr sicheres Online-Konto heruntergeladen werden.

Wie wähle ich aus den verschiedenen NGSelect-Diensten den richtigen aus?

NGSelect gliedert sich in vier Hauptkategorien, die von Ausgangsmaterial, DNA, RNA, Amplikons oder Ready-to-Load-Bibliotheken abhängig sind. Jeder dieser Dienste bietet eine Vielzahl von Optionen, mit denen individuelle und erschwingliche NGS-Projekte entworfen werden können. Weitere Informationen finden Sie in Tabelle 2 (nachstehend):

Überblick über die verschiedenen Dienstleistungen bei NGSELECT

Wohin soll ich meine Proben schicken?

Eurofins Genomics Europe Sequencing GmbH
Jakob-Stadler-Platz 7
78467 Konstanz
Germany

Fragen zu NGSelect RNA

Welches Ausgangsmaterial wird akzeptiert?

Eine Liste der akzeptierten Ausgangsmaterialien einschließlich der jeweiligen Mengen finden Sie in Tabelle 1 unter Produktspezifikationen.

Brauche ich immer eine genomische Referenzsequenz?

In der Regel muss vor Projektbeginn ein klar definierter Ensembl-Name für die annotierte genomische Referenzsequenz zur Verfügung gestellt werden. Alternativ kann die Genomsequenz im Fasta-Format (zusammen mit der entsprechenden Annotation im Gene Transfer Format (GTF)) oder im GenBank-Format (einschließlich Annotation) bereitgestellt werden.

Welche Art von führen Sie durch?

Qualität und Quantität jeder Probe werden mit entsprechenden Methoden bestimmt (z. B. Agarosegel-Analyse / Qubit® Fluorometer / NanoDrop / Agilent 2100 Bioanalyzer). Weitere Qualitätskontrollen erfolgen bei nahezu allen Schritten des Prozesses.

Was soll ich tun, wenn meine Probe die Eingangs-QK nicht besteht?

Sollten die Menge, Konzentration oder Qualität des Ausgangsmaterials die Voraussetzungen für die Weiterverarbeitung der Probe nicht erfüllen, werden wir Sie kontaktieren und mit ihnen das weitere Vorgehen für das Projekt besprechen. Sofern möglich wird Eurofins Genomics Ihnen dann Empfehlungen zur Optimierung der Probenqualität geben.

Welche Art von BioIT bieten Sie an?

Eine kostengünstige, hochwertige bioinformatische Analyse einschließlich Datenfilterung und QK ist für jedes Paket erhältlich.

Kann ich die Ergebnisse für diagnostische Zwecke verwenden?

Ja, auf Wunsch kann der Service unter diagnostischen Bedingungen mit ISO 17025-zertifizierten Arbeitsabläufen durchgeführt werden.

Wo erhalte ich meine Ergebnisse und in welcher Form werden sie geliefert?

Alle Rohdaten sowie die analysierten Daten können über Ihr sicheres Online-Konto heruntergeladen werden.

Wie wähle ich aus den verschiedenen NGSelect-Diensten den richtigen aus?

NGSelect gliedert sich in vier Hauptkategorien, die von Ausgangsmaterial, DNA, RNA, Amplikons oder Ready-to-Load-Bibliotheken abhängig sind. Jeder dieser Dienste bietet eine Vielzahl von Optionen, mit denen individuelle und erschwingliche NGS-Projekte entworfen werden können. Weitere Informationen finden Sie in Tabelle 2 (nachstehend):

Überblick über die verschiedenen Dienstleistungen bei NGSELECT

 

Wohin soll ich meine Proben schicken?

Eurofins Genomics Europe Sequencing GmbH
Jakob-Stadler-Platz 7
78467 Konstanz
Germany

Fragen zu NGSelect Ready-To-Load

Welches Ausgangsmaterial wird akzeptiert?

Eine Liste der akzeptierten Ausgangsmaterialien einschließlich der jeweiligen Mengen finden Sie in Tabelle 1 unter Produktspezifikationen.

Welche Art von Qualitätskontrolle führen Sie durch? 

Alle eingegangenen Ready-to-Load-Bibliotheken werden einer Qualitäts- und Quantitätskontrolle unterzogen. So wird die passende Sequenzierungsverdünnung bestimmt und es werden optimale Cluster-Dichten erzielt.

Was soll ich tun, wenn meine Probe die Eingangs-QK nicht besteht?

Sollten die Menge, Konzentration oder Qualität der sequenzierbereiten Bibliothek die Voraussetzungen für die Weiterverarbeitung der Probe nicht erfüllen, werden wir Sie kontaktieren und mit ihnen das weitere Vorgehen für das Projekt besprechen. Sofern möglich wird Eurofins Genomics Ihnen dann Empfehlungen zur Optimierung der Probenqualität geben. 

Welche Art von BioIT bieten Sie an?

Eine kostengünstige und professionelle bioinformatische Analyse steht auf Anfrage zur Verfügung. Weitere Informationen finden Sie unter „Produktspezifikationen“.

Kann ich die Ergebnisse für diagnostische Zwecke verwenden?

Ja, auf Wunsch kann der Sequenzierdienst unter diagnostischen Bedingungen mit ISO 17025-Akkreditierung durchgeführt werden.

Wo erhalte ich meine Ergebnisse und in welcher Form werden sie geliefert?

Alle Rohdaten sowie die analysierten Daten können über Ihr sicheres Online-Konto heruntergeladen werden.

Garantieren Sie eine bestimmte Anzahl an Reads?

Die tatsächliche erzielte Sequenzierungsleistung (Read-Länge, Read-Qualität und Anzahl der Reads) korreliert direkt mit der Qualität der verwendeten Sequenzierungsbibliothek. GATC Biotech kann keine Garantien für Sequenzierungsdaten aus kundenseitig erstellten Ready-to-Load-Bibliotheken geben. Sollte es aufgrund von technischen Problemen mit den Sequenzierungskits oder -geräten zu unbefriedigenden Sequenzierungsergebnissen kommen, wird die Sequenzierung ohne zusätzliche Kosten für den Kunden wiederholt.

Ist das Sortieren von gemultiplexten Sequenzen inbegriffen?

Das Sortieren von Rohdaten gemäß Illumina Index Read ist inbegriffen. Der verwendete Index-Typ (Single Index oder Dual Index) sowie die entsprechenden Index-Sequenzen müssen vor dem Projektbeginn zur Verfügung gestellt werden.
Die Sortierung der Rohdaten nach kundenspezifischen Markierungen (Tags) zu Beginn des Reads kann gegen Aufpreis angeboten werden. Wir empfehlen dringend, die „lineare“ Barcode-Strategie zu vermeiden und stattdessen das Indexsystem von Illumina zu verwenden (d. h. die Barcodes werden in einem separaten Read gelesen und die Registrierung von Clustern wird nicht beeinträchtigt). Es ist unbedingt auf eine ausgewogene Basenzusammensetzung der Indizes zu achten, damit die Bildanalyse-Software die einzelnen Signale optimal unterscheiden kann.

Welche Schritte werden unternommen, um die Sequenzierungsqualität zu erhöhen?

Die Cluster-Erkennungsalgorithmen von Illumina sind so optimiert, dass die A-, T-, G- und C-Nukleotide gleichmäßig repräsentiert sind. Jede Abweichung von einer gleichmäßigen Verteilung der Basen wirkt sich negativ auf die Menge und die Qualität der erzeugten Sequenzierungsdaten aus. Bei Proben mit geringer Vielfalt oder unausgewogener Basenzusammensetzung (z. B. Amplikons, bisulfitkonvertierte Proben) wird zur Verbesserung des Nukleotid-Gleichgewichts der Bibliothek ein PhiX-„Spike-in“ (20%) eingesetzt. Das Ausmaß, in dem die negativen Auswirkungen der unausgewogenen Basenzusammensetzung durch das „Spike-in“ der PhiX-Kontrolle reduziert werden, ist von der einzelnen Probe und den Sequenzeigenschaften abhängig. Weitere Informationen entnehmen Sie bitte der Illumina-Website.

Wie wähle ich aus den verschiedenen NGSelect-Diensten den richtigen aus?

NGSelect gliedert sich in vier Hauptkategorien, die von Ausgangsmaterial, DNA, RNA, Amplikons oder Ready-to-Load-Bibliotheken abhängig sind. Jeder dieser Dienste bietet eine Vielzahl von Optionen, mit denen individuelle und erschwingliche NGS-Projekte entworfen werden können. Weitere Informationen finden Sie in Tabelle 2 (nachstehend):

Überblick über die verschiedenen Dienstleistungen bei NGSELECT

Fragen zu GATCLiquid Oncoexome

Welche Art von kann mit GATCLiquid Oncoexome verarbeitet werden?

Für Oncoexome akzeptieren wir frische oder aufbewahrte Plasmaproben, sowie bereits isolierte zellfreie DNA. Weiteres entnehmen Sie bitte unserem Informationsblatt zur Probenvorbereitung für GATCLiquid (siehe "Dateien"). Die ctDNA wird aus Blutplasma extrahiert.
Für Ausgangsmaterial wie z. B. aus FFPE und Gewebeproben isolierte DNA sehen Sie sich bitte unser Produkt Inview Human Exome an.

Wie viel Ausgangsmaterial wird benötigt?

In der Regel benötigen wir entweder 4 ml Plasma oder 15 ng bereits isolierte zellfreie DNA(bis zu 30 µl /Konzentration > 0,5 ng/µl). 

Welche der Sequenzierung vorausgehenden Leistungen stehen zur Verfügung?

Das Produkt Oncoexome umfasst mehrere Leistungen im Vorfeld der Sequenzierung, z. B. ctDNA-Extraktion aus Plasma und Bibliothekerstellung mit hoher Komplexität und niedriger Duplikatrate. Die gezielte Suche von Exons erfolgt mit SureSelect von Agilent, das eine überdurchschnittliche Exon-Anreicherung und gleichförmige Abdeckung bietet.

Was für eine Sequenzabdeckung soll ich verwenden?

Die erforderliche Abdeckung ist von der erforderlichen Empfindlichkeit der Variantenerkennung abhängig. Sie können die Sequenzabdeckung wählen, die Sie für Ihr individuelles Projekt und Studienziel benötigen.
Basierend auf Erfahrungen aus der Analyse zellfreier DNA von mehr als 40.000 Proben bis zum heutigen Tag empfehlen wir generell eine Abdeckung von 100x.

Welche Art von Qualitätskontrollen führen Sie durch?

Qualität und Quantität jeder Probe werden nach Eingang der Probe bestimmt. Weitere Qualitätskontrollen erfolgen bei verschiedenen Schritten des Prozesses.

Welches Produkt soll ich wählen – Oncoexome, Oncopanel oder Oncotarget?

Alle drei Tests beruhen auf Flüssigbiopsie. Bei allen drei Produkten handelt es sich um leistungsstarke, nichtinvasive Hilfsmittel zur Charakterisierung von Tumoren in Echtzeit. Mit ihrer Hilfe kann die gesamte Heterogenität der Erkrankung erfasst werden.

GATCLiquid Oncoexome ist der erste kommerziell erhältliche Service für die Gesamtexom-Sequenzierung (WES) von ctDNA. Mit diesem Service erhalten Sie ein umfassendes Profil aller Mutationen in den proteinkodierenden Bereichen des Genoms. Dieses Produkt eignet sich für einen ersten Blick auf das Genom eines mutmaßlichen Krebspatienten in Fällen, in denen nur begrenzte Informationen über klinisch relevante Mutationen zur Verfügung stehen.

GATCLiquid Oncopanel ist ein umfassendes NGS-Panel zur Charakterisierung wichtiger Krebsmutationen. Mittels Einzelmolekül-PCR zielt dieses Panel auf 50 bekannte Krebsgene einschließlich Tumorsuppressoren, Hotspots und Resistenz-Markern. Hinsichtlich der Sequenzabdeckung und Gleichförmigkeit mit einer Sensitivität von ca. 1 % setzt das Panel einen neuen Standard in der Branche.

GATCLiquid Oncotarget ermöglicht den ultrasensitiven Nachweis von klinisch relevanten krebsspezifischen Punktmutationen, Insertionen, Deletionen und Genfusionen in zirkulierender Tumor-DNA bis zu einer Allelfrequenz von 0,1 %. Diese Methode eignet sich für die Therapieüberwachung, da sie empfindlich genug ist, um ein Rezidiv in sehr frühem Stadium zu erkennen.

Wie erhalte ich meine Ergebnisse und in welcher Form werden sie geliefert?

Alle Ergebnisse können über Ihr sicheres Online-Account heruntergeladen werden.

Wie schnell soll ich die Probe nach der Blutentnahme versenden?

Blutproben müssen innerhalb von 24 Stunden nach der Blutentnahme an GATC Biotech versandt werden. Die Probe muss in Blutentnahmeröhrchen von BCT Streck gelagert werden. Die Proben können bei Raumtemperatur gelagert und geliefert werden. Plasmaproben müssen auf Trockeneis verschickt werden.

Wie viele Proben kann ich schicken?

Eurofins Genomics nimmt eine beliebige Anzahl von Proben in Vielfachen von vier an.

Wohin soll ich meine Proben schicken?

Eurofins Genomics Europe Sequencing GmbH
Jakob-Stadler-Platz 7
78467 Konstanz
Germany

Fragen zu Inview Microbiome Profiling 3.0

Welche Spezies können mit Hilfe der Mikrobiom-Analyse auf dem MiSeq detektiert werden?

Es können alle Bakterien, Archaeen und Pilze identifiziert werden, zu denen eine Sequenz in der NCBI Nukleotid Datenbank publiziert ist. Es gibt momentan zum Beispiel tausende bakterielle Spezies mit Sequenz-Einträgen in der Nukleotid Datenbank. Nah verwandte Arten mit fast identischen DNA-Sequenzen können nicht unterschieden werden. In diesen Fällen wird nur der Genus (oder die Familie) bestimmt.

Welche Einschränkungen gibt es bei der Verwendung von NGS für die Mikrobiom-Analyse?

  • Nah verwandte Spezies können aufgrund ihrer fast identischen Sequenz nicht sicher voneinander unterschieden werden.
  • Sehr starkt prozessierte Proben oder Proben mit einem sehr geringen pH enthalten zum Teil degradierte DNA. Dies macht eine Speziesbestimmung sehr schwierig und in manchen Fällen unmöglich.
  • Je mehr Ausgangsmaterial wir erhalten, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit gute Sequenzierergebnisse zu erzielen.

Wie hoch ist der Anteil an falsch positiven oder falsch negativen Ergebnissen?

Bei Proben mit stark degradierter DNA kann es sein, dass keine "Speziesidentifkation" möglich ist. Um falsch posistive Ergebnisse zu vermeiden, wird immer eine Negativkontrolle (Wasser) parallel zu den eigentlichen Proben prozessiert.

Mittels NGS kann jedes DNA Amplikon, das erfolgreich amplifiziert wird auch detektiert werden. Aufgrund der hohen Sensitivität der Methode, müssen Sequenzen, die nur sehr selten in der Probe vorkommen (low coverage) oder Sequenzen mit unerwarteter Sequenzlänge in der Datenanalyse entfernt werden, um falsch positive Ergebnisse, die durch PCR oder Sequenzierfehler entstanden sind, auszuschließen. Spezies, die durch weniger als 0,5% aller Reads abgedeckt werden, werden somit nicht in den PDF Report aufgenommen.

Wie ist die Lieferzeit der Mikrobiom-Analyse?

Die Lieferzeit hängt von der Anzahl der Proben und dem Paket-Typ ab. Wenn Sie z.B. die Mikrobiom-Analyse mit 1 Target bestellen, dann beträgt die Lieferzeit 3-5 Wochen. Zusätliche Services, wie die DNA-Extraktion oder die bioinformatische Auswertung verlängern die Lieferzeit. Detaillierte Lieferzeit finden Sie in den Paketbeschreibungen im Bestell-Prozess.

Wie sollte ich die Auswahl an Target-Regionen treffen?

Wählen Sie eines oder mehrere 16S Targets aus um die bakterielle Zusammensetzung in Ihrer Probe zu analysieren, und wählen Sie eines oder beide ITS Targets aus, um die Pilze in Ihrer Probe zu klassifizieren. Für die Analyse von Archaeen wählen Sie bitte das zugehörige 16S Target aus der Liste aus.

Keine der 16S oder ITS Primer Kombination ermöglicht die Amplifikation von allen Spezies. Es ist daher zu empfehlen, mehrere Primer Kombination zu verwenden um die komplette Mikrobiom Population zu analysieren (z.B. Ihrmark et al., 2012; Toju et al., 2012)

Kann ich mit dem Inview Microbiome Profiling 3.0 Paket auch Cyanobakterien detektieren?

Nein. Unsere Standard-Primer Sets sind nicht dazu geeignet, Cyanobakterien zu analysieren. Sollten Sie daran Interesse haben, dann fragen Sie bitte nach einem individuellen Projekt an.

Welche Qualitätskontrolle führen Sie bei meinen Proben durch?

Die PCR-Produkt Generierung dient uns als Qualitätskontrolle. Die PCR Bedingungen sind optimiert und der Erfolg der Amplikongenerierung ist von der Menge an bakterieller, archaeller oder Pilz-DNA in der Probe abhängig. Falls kein oder nur ein sehr schwaches Amplikon generiert werden kann, liegt dies in den meisten Fällen an einer zu geringen DNA-Menge. Standardmäßig wiederholen wir die Amplikongenerierung einmalig mit modifizierten Bedingungen in diesen Fällen.

Was passiert wenn Sie kein oder nur ein sehr schwaches Amplikon generieren können?

Wenn Eurofins Genomics bei einigen Ihrer Proben kein Amplikon erzeugen kann, dann werden wir die Bearbeitung dieser Proben einstellen und Ihnen die nicht erbrachten Sequenzierleistungen rückvergüten. Falls ein schwaches Amplikon generiert werden kann, dann wird Eurofins Genomics dieses in den Amplikonpool für die Sequenzierung mit aufnehmen. Erfahrungsgemäß werden für solche Amplikons auch nur wenige Reads generiert. Die Interpretation dieser Reads sollte mit besonderer Vorsicht erfolgen.

Kann ich Ersatzproben schicken? 

Es ist nicht möglich Ersatzproben für einen bestehenden Auftrag zu senden. Falls Sie weitere Proben schicken möchten, dann platzieren Sie bitte einen neuen Auftrag. Beide Aufträge werden unabhängig voneinander bearbeitet.

Werden meine Proben mit den Proben anderer Kunden auf einem Lauf sequenziert?

Ja. Ihre Proben werden gemeinsam mit den Proben anderer Kunden auf einem MiSeq Run sequenziert.

Werden Sie meine Proben nach der Prozessierung aufbewahren?

Ihre Proben werden unter geeigneten Bedingungen für 3 Monate nach der Analyse aufbewahrt. Im Anschluss werden die Proben entsorgt, falls keine gesonderten Absprachen vorliegen. Bitte beachten Sie, dass Eurofins Genomics möglicherweise das komplette Probenmaterial für die Analyse verwendet (abhängig davon wieviel Material Sie zu Verfügung stellen können).

Wenn wir das Microbiome Produkt 2nd PCR auswählen, können wir dann Amplikonproben einschicken, die aus mehreren verschiedenen Amplikons, generiert mit verschiedenen Primerpaaren bestehen?

Normalerweise würden Sie pro Probe 1 Amplikon senden, das mit 1 Primerpaar erzeugt wurde. In einigen Fällen können jedoch weniger Reads pro Amplikon erforderlich sein, wie in der Projektspezifikation angegeben. In solchen Fällen können die einzelnen Amplikonproben, die Sie senden, auch aus mehreren Amplikons bestehen, die mit verschiedenen Primerpaaren generiert wurden. In diesem Fall werden wir jedoch keine Primersequenzen clippen und Rohdaten versenden.

Fragen zu Projekten / kundenspezifischen Lösungen

Welche Dienstleistungen bietet Eurofins Genomics im Bereich Next Generation Sequenzierung an?

Genom-Sequenzierung

  • De novo Sequenzierung von Pilzgenomen
  • De novo Sequenzierung von höheren, eukaryotischen Genomen
  • De novo Sequenzierung von BACs, Viren & Plasmiden
  • Resequenzierung von Genomen

Transkriptom Sequenzierung

  • De novo Transkriptom-Sequenzierung
  • Expression profiling

Resequenzierung & Amplikons

  • Ultratiefe Amplikon-Sequenzierung
  • Resequenzierung mit Hilfe von Sequence Capture
  • Exom-Sequenzierung

Bioinformatik

  • Bioinformatische Lösungen
    wie zum Beispiel den novo Assembly, Mapping, Amplikonvarianzanalyse ...

Wohin schicke ich meine Proben?

Im Falle einer Online Bestellung wird Ihnen am Ende der Bestellung das zuständige Labor angezeigt.

Für Projekte mit einem PDF Angebot, finden Sie die Information in dem Angebot selbst.

Eurofins hat zwei Standorte, wo ihre Proben bearbeitet werden.

Eurofins Genomics
NGS - Laboratory
Anzinger Str. 7a
85560 Ebersberg
Germany

 

Eurofins Genomics Europe Sequencing GmbH
Jakob-Stadler-Platz 7
78467 Konstanz
Germany

Was ist das Prinzip der Illumina HiSeq 2000 Sequenziertechnologie?

Bei der Illumina HiSeq 2000 / MiSeq Technologie werden die zu sequenzierenden DNA-Fragmente zunächst mit der sogenannten Brücken-PCR (Bridge-PCR) amplifiziert. Die Sequenziertechnologie basiert auf dem Einsatz reversibler Farbstoff-Terminatoren.

Bei der Brücken-PCR werden die DNA-Matrizen und Primer an eine zweidimensionale Oberfläche immobilisiert. Die Primer sind so konzipiert, dass sie an die Adaptoren der DNA-Fragmente hybridisieren. In jedem PCR-Zyklus binden die DNA-Fragmente daher an die Primer in der Umgebung und bilden sogenannte Brücken aus. Durch den nachfolgenden Denaturierungsschritt entstehen wieder einzelsträngige, auf der Oberfläche verankerte DNA-Fragmente (Cluster). Für die Sequenzierung der Cluster wird ein universeller Primer an die Adaptoren der DNA-Fragmente hybridisiert.

faq 9.1

Die Sequenzierung der generierten Cluster erfolgt durch die Replikation des komplementären Strangs mit reversiblen Farbstoff-Terminatoren. Dieses sind Desoxynukleotide, die ein Fluorophor und eine Blockierungsgruppe tragen. An die 4 Nukleotide sind jeweils unterschiedliche Fluorophore gebunden. Da die Blockierungsgruppe die DNA-Synthese abbricht, wird der Strang jeweils nur um ein markiertes Nukleotid verlängert. Die Oberfläche wird anschließend gewaschen, um nicht eingebaute Nukleotide zu entfernen. Um die Identität des eingebauten Nukleotids zu identifizieren, wird das Fluoreszenzsignal analysiert. Im Anschluss wird das Fluorophor und die Blockierungsgruppe von dem Nukleotid abgespalten. Die entstehenden vierfarbigen Bilder werden für die Sequenzbestimmung genutzt.

faq 9.2

 

Welche Daten liefern Sie für Illumina HiSeq and MiSeq Projekte aus?

Für Projekte mit dem Illumina HiSeq oder MiSeq erhalten Sie von uns die FASTQ Dateien jedes einzelnen Reads. Die Intensitätswerte und Bilddateien werden während des Laufs automatisch gelöscht und können nicht mitgeliefert werden.

Verfügen Sie über Referenzen für Next Generation Sequenzierung?

Ja wir haben Referenzkunden für alle NGS Anwendungen. Eine Auswahl einiger Publikationen finden sie hier.

Falls Sie eine Referenz für eine spezifische Anwendung benötigen, können Sie uns auch einfach unter genseq-eu@eurofins.com kontaktieren.

Wie liefere ich eine Referenz-Sequenz?

Bitten senden Sie uns die Sequenz in Form eines FASTA- oder NCBI-Files oder übermitteln Sie uns die exakte Referenzsequenz.

Bitte liefern Sie uns die Referenzsequenz per E-Mail an genseq-eu@eurofins.com oder an Ihre Kontaktperson aus dem Vertrieb.

Kann ich eine Vertraulichkeitsvereinbarung erhalten (CDA / NDA)?

Ja. Wir halten entsprechende Vorlagen für Sie bereit. In der Regel sind wir auch gerne bereit, Ihre Vorlage zu verwenden.

Selbstverständlich verpflichten wir uns in unseren Angeboten und allgemeinen Geschäftsbedingungen, Ihre Projekte höchst vertraulich zu behandeln.

Besitze ich das Eigentumsrecht (Intellectual Property) an meinen Daten?

Ja. Als Dienstleistungsunternehmen erheben wir keinerlei Ansprüche auf das geistige Eigentum der von uns bearbeiteten Projekte.

Was bedeutet Coverage Sequenzierung?

Bei der Coverage Sequenzierung wird die DNA so lange sequenziert, bis eine bestimmte Menge an Sequenz-Information - und somit eine bestimmte Abdeckung der Sequenz - erreicht ist.

Beispiel:

  • Für eine einfache Coverage eines Genoms von 3 Mb müssen 3 Millionen Basenpaare sequenziert werden.
  • Für eine 6-fache Coverage ist die Sequenzierung von 18 Millionen Basenpaaren nötig.


Für die Sequenzierung auf Illumina HiSeq 2500 empfehlen wir eine 30-50-fache Coverage.

Wie werden die Daten ausgeliefert?

In Abhängigkeit der Datenmenge versenden wir Ihre Sequenzdaten auf DVDs, USB-Sticks oder Festplatten.

Zusätzlich haben sie die Möglichkeit Ihre Daten von unserem "secure FTP" Server herunterzuladen.

Welche Methoden der Konzentrations- und Qualitätsbestimmung für RNA empfehlen Sie?

Um Ihnen hochwertige Sequenzierdaten zukommen zu lassen, benötigen wir hochwertige Gesamt-RNA.

Für die Konzentrationsbestimmung Ihrer isolierten Gesamt-RNA empfehlen wir entweder spektrometrische Methoden, wie das NanoDrop-System oder Chip-basierte elektrophoretische Methoden, wie den Agilent 2100 Bioanalyzer. Abschätzungen über die RNA-Integrität können entweder mit traditioneller RNA-Gel-Elektrophorese oder mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer getroffen werden. In jedem Fall beginnen wir erst dann mit der Herstellung der Bibliothek, wenn Ihre RNA-Probe unsere Qualitätskontrolle erfolgreich bestanden hat.

Welche bioinformatischen Analysen bieten Sie für die Transkriptom-Sequenzierung an?

Typische bioinformatische Dienstleisungen nach einer Transkriptom-Sequenzierung sind: 

Was bedeutet Clustering?

Unter Clustering versteht man den bioinformatischen Prozess, um Sequenzen einer definierten Ähnlichkeit zu gruppieren. Im Unterschied zum Mapping kann das Clustering unabhängig von einer verfügbaren Referenz-Sequenz durchgeführt werden.

Routinemäßig wird Clustering durchgeführt, um

  • Expressionsprofile verschiedener mRNA-Proben zu vergleichen
  • Sequenzen aus Amplikon-Projekten zu gruppieren

Was ist eine de novo Assemblierung?

Eine de novo Assemblierung ist eine Assemblierung von Sequenzen unabhängig von der unterstützenden Information eines Referenz-Genoms von einem verwandten Organismus. Eine de novo Assemblierung kann daher im Vergleich zu der Sequenz des verwandten Organismus eine sehr unterschiedliche Sequenz liefern. Der Vorteil dieser Methode ist daher, dass größere Restrukturierungen, sowie Insertionen und Deletionen schnell detektiert werden können.

Was ist der Unterschied zwischen einem Scaffold und einem Contig?

„Zusammenhängende Nukleotid-Sequenzen“ (Contigs) werden bei Genom-Assemblierungen durch multiple Alignments von ähnlichen Einzel-Sequenzen gebildet. Nach den Alignments liegen multiple Konsensus-Sequenzen aller assemblierten Sequenzen vor, die die Contigs eines Genoms oder der Assemblierung darstellen.

Im Gegensatz dazu ist ein Scaffold eine geordnete Abfolge von Contigs, die durch die Paired-End-Information aus der Sequenzierung von Long-Jumping-Distance Banken oder Mate-Pair-Banken erstellt wird. Scaffolds bestehen immer aus einer Abfolge von Contigs, die durch Lücken voneinander getrennt sind. Diese Lücken können in der Konsensussequenz durch „NNNN“ dargestellt sein.

Was ist ein Mapping?

Im Gegensatz zu einer de novo Assemblierung ist eine auf Mapping basierende Assemblierung (mapped assembly) strikt von einer Referenz-Sequenz abhängig und beinhaltet den Vergleich von Sequenzen mit einer Referenz-Sequenz sowie das Mapping von ähnlichen Sequenzen auf die Referenz-Sequenz. Wenn die Einzel-Sequenzen überlappen, können auch Contigs gebildet werden. Das Mapping erlaubt das Studieren von Mutationen (z.B. SNPs) oder strukturellen Varianten.

Bieten Sie BLASTx- und BLASTn-Analysen an?

Ja. Wir bieten sowohl BLASTx- als auch BLASTn-Alignments gegen Protein- und Nukleotid-Datenbanken an.

Unterschied zwischen BLASTx- und BLASTn-Analyse

Bei der BLASTx-Analyse wird die DNA-Sequenz in alle möglichen Leserahmen translatiert und mit der nichtredundanten NCBI-Protein-Datenbank verglichen. Bei der BLASTn-Analyse wird die DNA-Sequenz mit einer ausgewählten Nukleotid-Datenbank verglichen.

Fragen zu INVIEW CRISPR Check

Welche Arten von Proben können mit INVIEW CRISPR Check verarbeitet werden?

The starting material is amplicons prepared in your lab that span the mutation site. The amplicon generation protocol to apply depends on the product type (adaptor ligation or 2nd PCR workflow), instructions can be found in the tab "How to prepare your Amplicons" on the respective product webpage. Amplicon length requirements can be found in the tab "Specifications".

Als Startmaterial benötigen wir von Ihnen Amplikons, welche die Mutationsstelle überspannen. Das Vorgehen zur Amplikongenerierung hängt von dem Produkttyp ab (Adaptor Ligation oder 2nd PCR Workflow). Instruktionen können Sie auf der Webseite auf dem Tab "Probenvorbereitung" finden. Anforderungen zur Amplikonlänge finden Sie auf dem Tab "Spezifikationen". 

Warum empfehlen Sie eine relativ engen Bereich, innerhalb dem das Wildtyp-Amplikon liegen sollte?

 

Die Amplikonlänge (Wildtyp) muss an die Länge der InDels angepasst werden, die Sie detektieren möchten. Zudem muss die Amplikonlänge ein Merging überlappender Reads zulassen. Üblicherweise sind die Mutationen die Sie mit CRISPR (NHEJ Pathway) einführen im Bereich von 1-20 bp). Um auch größere InDels nicht von der Analyse auszuschließen muss die Wildtyp Amplikongrößer in einem bestimmten Größenbereich liegen.

Sie finden in unserem Sample Preparation Guide die Längenanforderungen für alle Produkttypen und für zwei Beispiel Anwendungsfälle. 

 

Können wir Ihren Service auch nutzen wenn wir mit einem anderen CRISPR System arbeiten als dem SpCas9 System?

Ja, Sie können. In diesem Fall benötigen wir für die Analyse das Schnittstellen Offset (Distanz in Nukleotiden upstream der PAM Sequenz, bei der der Doppelstrangbruch erwartet wird).

 

Haben Sie Empfehlungen für das Assay Setup?

  1. Bitte fügen Sie immer mindestens eine Wildtyp Kontrollprobe in Ihr Experiment ein.
  2. Wenn Sie eine sehr akkurate Bestimmung der Editing Efficiency benötigen, dann empfehlen wir Ihnen Replikate in die Analyse aufzunehmen. Replikate erhöhen die Genauigkeit der Effizienzbestimmung, sind aber nicht zwingend notwendig.

Wie unterscheidet sich INVIEW CRISPR Check Adaptor Ligation und INVIEW CRISPR Check 2nd PCR?

Beide Produkte sind exzelleente Lösungen um Mutationen zu untersuchen die mit dem CRISPR/Cas System (NHEJ pathway) eingeführt wurden.

The Produkte unterscheiden sich vor allem in der Library Generierung (2-Step Protokoll versus Adaptor Ligations Protokoll) and damit in der Amplikon-Probenvorbereitung. 

Ein Selection Guide ist auf der CRISPR Webseite verfügbar (Tab Overview) um Ihnen zu helfen die beste Lösung für Ihre individuellen Präferenzen und Gegebenheiten zu finden.

Wie sieht der Lieferumfang aus?

  • Umfassender Bericht mit Abschnitten zu Ergebnissen und Methoden
  • Rohdaten als FASTQ Dateien
  • FASTQ Sequenzen nach Qualitäts-Clipping und Merging
  • Gemappte Reads im BAM Format
  • Sequenz des Wildtypallels und alternativer Allele inklusive deren Quantität 
  • Metriken zu Rohdaten, Präprozessierungs-Daten, Mappingergebnisse und Coverage im CSV-Format
  • Berechnete Editing Effizienz pro Probe

Wie erhalte ich meine Ergebnisse?

Für das Produkt INVIEW CRISPR Check 2nd PCR können Sie die Ergebnisse von unserem sicheren FTP Server herunterladen (passwort wird Ihnen mitgeteilt). Für das Produkt INVIEW CRISPR Check Adaptor Ligation stellen wir Ihnen die Ergebnisse über Ihren Ecom Account zu Verfügung.

Wohin soll ich meine Proben schicken?

Eurofins Genomics Europe Sequencing GmbH
Jakob-Stadler-Platz 7
78467 Konstanz
Germany

Können wir für das Produkt INVIEW CRISPR Check 2nd PCR Amplikonproben einschicken, die aus mehreren verschiedenen Amplikons, generiert mit verschiedenen Primerpaaren bestehen?

 

Normalerweise würden Sie pro Probe 1 Amplikon senden, das mit 1 Primerpaar erzeugt wurde.

In einigen Fällen können jedoch weniger Reads pro Amplikon erforderlich sein, wie in der Projektspezifikation angegeben. In solchen Fällen können die einzelnen Amplikonproben, die Sie senden, auch aus mehreren Amplikons bestehen, die mit verschiedenen Primerpaaren generiert wurden. In diesem Fall werden wir jedoch keine Primersequenzen clippen und Rohdaten versenden.

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