Der Comfort Upgrade beinhaltet:
- Qualitätskontrolle der eingehenden DNA
- Konzentrationseinstellung für jede gereinigte DNA
- Individuelle Reaktionsbedingungen gemäß durchgeführter Qualitätskontrolle und Probenspezifikation
- Spezielle Chemie, falls zutreffend
- Manuelle Analyse des Sequenzierungsergebnisses
- Wiederholung fehlgeschlagener Sequenzierläufe mit angepasstem Probenvolumen, Reaktionsbedingungen und Chemie, sofern zutreffend
Probenvorbereitung für Plasmid-DNA, gereinigte PCR-Produkte und premixed Proben (Mischung aus DNA und Primern)
- Verwenden Sie unser PlateSeq Ultimate Kit für gereinigte DNA und vorgemischte Proben
- Alternativ können Sie die 96well PCR Platte aus unseren Accessories oder Ihre eigene 96well Platte verwenden
- Eine Platte kann gleichzeitig Plasmid DNA und aufgereinigte PCR Produkte enthalten
- Die Fragmentgröße sollte sich nicht um mehr als den Faktor 3 voneinander unterscheiden
- Es muss eine Normalisierung der DNA-Konzentrationen über die gesamte Platte erfolgen*
- Bitte halten Sie eine Plattenposition für die interne Qualitätskontrolle frei
- Schicken Sie uns Ihre DNA-Proben flüssig mit einem Gesamtvolumen von je 15 µl
- Verschließen Sie Ihre Platten mit 8-Cap Strips, um Materialverluste zu verhindern
- Falls Sie Ihre eigenen Platten verwenden wollen, verwenden sie bitte unsere PlateSeq Labels um diese zu kennzeichnen
- Versenden Sie die Proben bei Raumtemperatur an unser Sequenzierlabor in Ebersberg
Probenart
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Produktlänge
|
Konzentration
|
Volumen
|
Plasmid DNA |
--- |
50-100 ng/µl |
15 µl |
Gereinigte PCR Produkte |
150-300 bp |
1 ng/µl |
15 µl |
|
300-1000 bp |
5 ng/µl |
15 µl |
|
1000-3000 bp |
10 ng/µl |
15 µl |
Premixed Proben (Mischungen aus DNA und Primer):
- Templates sollten aus 15 µl aufgereinigter DNA in einer der in der obigen Tabelle angegebenen Konzentrationen bestehen
- Fügen Sie 2 µl Primer mit einer Konzentration von 10 pmol/µl hinzu
- Das Gesamtvolumen Ihrer voreingestellten Probe muss 17 µl betragen
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Probenvorbereitung für ungereinigte PCR Produkte
- Verwenden Sie unseren PlateSeq Ultimate Kit für ungereinigte PCR Produkte
- Alternativ können Sie die 96well PCR Platte aus unseren Accessories oder Ihre eigene 96well Platte verwenden
- Die DNA-Konzentration sollte nicht um mehr als den Faktor 3 schwanken; Als Orientierung können die Werte in der folgenden Tabelle dienen. Die Konzentration wird dann nach der Reinigung stichprobenartig gemessen, um konsistente Sequenzierungsbedingungen für die Platte sicherzustellen.
- Die Fragmentgröße ungereinigter PCR Produkte sollte sich nicht um mehr als den Faktor 3 voneinander unterscheiden
- Bitte halten Sie eine Plattenposition für die interne Qualitätskontrolle frei
- Senden Sie die PCR Produkte flüssig mit einem Gesamtvolumen von je 15 µl
- Verschließen Sie Ihre Platten mit 8-Cap Strips, um Materialverlust zu verhindern
- Falls Sie Ihre eigenen Platten verwenden wollen, verwenden sie bitte unsere PlateSeq Labels um diese zu kennzeichnen
- Versenden Sie die Proben bei Raumtemperatur an unser Sequenzierlabor in Ebersberg
Probenart
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Produktlänge
|
Konzentration
|
Volumen
|
Ungereinigte PCR Produkte |
150-300 bp |
min. 4 ng/µl |
15 µl |
|
300-1000 bp |
min. 10 ng/µl |
15 µl |
|
1000-3000 bp |
min. 20 ng/µl |
15 µl |
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Probenvorbereitung für Plasmidklone als Stichkulturen in Agar
- Verwenden Sie entweder unseren PlateSeq Ultimate Kit für Plasmidklone oder die Agarplatte inkl. entsprechendem Antibiotikums aus unseren Accessories.
- Picken Sie jede einzelne Kolonie mit einem sterilen Zahnstocher aus der Agarschale und beimpfen Sie jeweils einen Well mit einer Kolonie
- Verschließen Sie die Platte luftdurchlässig und inkubieren Sie diese 8–12 Stunden (über Nacht) bei 37 °C
- Falls Sie Ihre eigenen Platten verwenden wollen, verwenden sie bitte unsere PlateSeq Labels um diese zu kennzeichnen
- Versiegeln Sie die Platte mit einer selbstklebenden Plastikfolie und schicken Sie uns Ihre Stichkulturen bei Raumtemperatur an unser Sequenzierlabor in Ebersberg
Probenvorbereitung für Plasmidklone als Glyzerinkulturen
- Verwenden Sie ausschließlich transparente 96well Mikrotiterplatten mit einem Fassungsvolumen von 350 µl/Well
- Füllen Sie jedes Well mit 200µl flüssigem Medium (z.B. LB-Medium) inkl. entsprechendem Antibiotikum und fügen Sie 40 µl Glyzerin hinzu (erforderliche Glyzerinkonzentration: 10-20%)
- Schicken Sie uns flüssige Kulturen ausschließlich in Glyzerin!
- Picken Sie jede einzelne Kolonie mit einem sterilen Zahnstocher aus der Agarschale und beimpfen Sie jeweils einen Well mit einer Kolonie. Oder transferieren Sie Klone aus bereits eingelagerten Glycerinkulturen mittels Multi-Kanal-Pipette in eine frisch hergestellte 96 well Glycerinplatte
- Verschließen Sie die Platte luftdurchlässig und inkubieren Sie diese 8–12 Stunden (über Nacht) bei 37 °C
- Achten Sie darauf, dass die Plattenoberfläche trocken ist, bevor Sie die Platte sehr dicht mit Klebefolie versiegeln, um Materialverluste zu verhindern
- Kennzeichnen Sie die Platte mit unseren PlateSeq Labels
- Frieren Sie die Platte bei - 80 °C ein
- Versenden Sie die Glyzerinkulturen auf ausreichend Trockeneis zur Konservierung Ihrer Proben an unser Sequenzierlabor in Ebersberg
Bitte liefern Sie uns folgende Konzentrationen und Volumina:
Probenart
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Produktlänge
|
Konzentration
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Vol. 1-8 Rkt.
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Plasmid DNA |
< 30 kbp |
50-100 ng/µl |
15 µl |
BAC/PAC/Cosmid DNA |
30-200 kbp |
200-1000 ng/µl |
15 µl |
Gereinigte PCR Produkte |
150-300 bp |
1 ng/µl |
15 µl |
|
300-1000 bp |
5 ng/µl |
15 µl |
|
1000-3000 bp |
10 ng/µl |
15 µl |
Ungereinigte PCR Produkte |
150-300 bp |
4 ng/µl |
15 µl |
|
300-1000 bp |
10 ng/µl |
15 µl |
|
1000-3000 bp |
20 ng/µl |
15 µl |
Premixed Proben (Mischungen aus DNA und Primer):
- Templates sollten aus 15 µl aufgereinigter DNA in einer der in der obigen Tabelle angegebenen Konzentrationen bestehen
- Fügen Sie 2 µl Primer mit einer Konzentration von 10 pmol/µl hinzu
- Das Gesamtvolumen Ihrer voreingestellten Probe muss 17 µl betragen
Bitte senden Sie uns Ihre Proben ausschließlich wie unten beschrieben zu:
- Verwenden Sie 1,5ml „Safe Lock“-Tubes für Ihre Templates und Primer
- Verkleben oder umwickeln Sie Ihre Tubes nicht mit Parafilm. „Safe Lock“-Tubes schließen perfekt ab und schützen vor Verdunstung.
- Etikettieren Sie Ihre Proben mit unseren Barcode Labels. Bringen Sie das Etikett horizontal an
Profitieren Sie von größtmöglicher Flexibilität für Ihre Sequenzier-Primer
Dank unserer hauseigenen DNA-Synthese, unserer umfassenden Bioinformatik-und IT-Expertise haben Sie die freie Wahl, wie Sie uns Ihre Sequenzier-Primer zukommen lassen:
- Wählen Sie einen unserer gelagerten Standard Primer
Wählen und verwalten Sie Ihre bevorzugten Standard Primer aus einer Liste von 80 validierten Primern.
- Bestellen Sie Ihre eigenen Sequenzier-Primer
Bestellen Sie die Synthese benötigter Primer direkt zu Ihrer Sequenzierung. Wir bewahren diese Primer 4 Wochen für Sie auf. (Lagerung der Primer für ein Jahr auf Anfrage). In diesem Zeitraum können Sie sie jederzeit bequem wiederverwenden.
- Schicken Sie uns Ihre eigenen Sequenzier-Primer
Sie können uns Ihre Sequenzier-Primer in separaten 1.5 ml Tubes gemeinsam mit Ihren Proben schicken. Verwenden Sie dafür unsere kostenlosen Primer Barcodes. Beigefügte Primer werden 10 Tage gelagert.
- Premixed Proben (Mischung aus DNA und Primer)
Sie können Primer auch direkt zu Ihrem DNA-Template dazugeben und uns als DNA / Primer - Gemisch zu uns senden.
Bitte beachten Sie die optimalen Primerbedingungen, Konzentration und Volumen wie unten beschrieben.
Optimale Primer-Bedingungen:
- Primer dürfen weder Phosphorylierung noch Fluoreszenzfarbstoffe enthalten
- Die optimale Primerlänge liegt zwischen 16 und 25 Basen
- Die Schmelztemperatur des Primers sollte 50 - 62°C betragen
- Der GC-Gehalt des Primers sollte bei 35-60% liegen
- Idealerweise sollte ein G oder C am 3’-Ende liegen
- Die Anzahl der 3' Gs oder Cs sollte nicht größer als 2 Gs oder Cs sein
- Wenn möglich, vermeiden Sie >3 identische Basen hintereinander in der Sequenz
Primer-Konzentration und -Volumen:
- Pro Sequenzierreaktion werden exakt 10 pmol/µl Primer-Konzentration benötigt
- Jeder Primer muss ein Gesamtvolumen von 15 µl haben. (in bi-destilliertem Wasser oder 5mM Tris-HCl)*
- Die Konzentration von Primern mit Wobbles muss nach folgender Formel berechnet werden: nX x ConcPrimer
Bitte senden Sie Ihre Proben an:
Eurofins Genomics
Sequencing Lab
Anzingerstraße 7a
DE - 85560 Ebersberg
Verwenden Sie eines unserer Versandoptionen um Ihre Proben per Post oder Kurier zu uns zu senden. Stellen Sie sicher, dass Sie Ihre Proben sicher verpacket sind.
Aufbewahrung von Proben und Primer:
- Lagerung der DNA für 4 Wochen
- Kostenlose Lagerung der synthetisierten Primer für 4 Wochen
- Aufbewahrung von synthetisierten Primern für ein Jahr gegen Aufpreis
- Kostenlose Lagerung von mitgesendeten Primern für 10 Tage
Datenspeicherung:
- Sichere Online-Archivierung aller ausgewählten Sequenzdaten für 6 Monate
Definition technische Ursachen
Unter einem technischen Ausfall versteht man einen chemischen oder technischen (IT, Maschinen) Defekt in unserem Labor. Um sicherzustellen, dass die Qualität der Sequenzierung nicht durch einen
technischen Ausfall beeinträchtigt wird, wird bei jedem Sequenzierungslauf eine interne Qualitätskontrolle durchgeführt. Darüber hinaus analysiert eine hochentwickelte Software jede Platte unter
Berücksichtigung von Parametern wie Qualitätswerten (QV) und Leselängen.
Zu diesem Zweck sollte die Position H12 bei Proben in Platten leer gehalten werden, da sonst eine Qualitätskontrolle nicht möglich ist.
Wenn die oben genannten Parameter einen bestimmten Prozentsatz unterschreiten, wird eine zusätzliche manuelle Überprüfung durchgeführt.
Wenn durch diese manuelle Prüfung ein technischer Fehler bestätigt wird, wird der Sequenzierungslauf wiederholt.