PCR Primer Design

Eurofins Genomics' PCR Primer Design Tool verwendet das Prime+ Programm des GCG Wisconsin Package das ursprünglich von Irv Edelman geschrieben wurde.

Das PCR Primer Desgin Tool analysiert die eingegebene DNA Sequenz und ermittelt die optimalen PCR Primer-Paare. Zur Ermittlung der optimalen Primer müssen bestimmte Parameter der Primer und des PCR Produkts berücksichtigt werden. Diese Werte sind bereits als Standard vordefiniert. Sie können entweder diese Werte für das Design verwenden oder entsprechende Parameter für eine individuelle Analyse verändern.

Zielsequenz
Kopieren Sie die Zielsequenz aus Ihrer externen Quelle in das Textfeld. Die Zielsequenz kann entweder als DNA Sequenz oder im FASTA Format (beginnt mit einem ">" gefolgt von einem Namen) eingegeben werden. Zeilenumbrüche und Leerzeichen sind erlaubt. Die Zielsequenz kann Regionen mit degenerierte Basen (Wobbles) enthalten, die jedoch nicht für das Primer Design berücksichtigt werden.

Design Parameter
Das Design Tool verwendet standardmäßig die komplett eingegebene Zielsequenz. Sie können aber auch eine bestimmte Region für das Design der Primer definieren indem Sie die Anfangs- und Endposition festlegen. Falls Sie andere Basen als C/G am 3' Ende oder eine andere maximale Tm-Differenz der Primer-Paare benötigen, können Sie diese spezifizieren.

Primer Kriterien
Sie können ein Minimum und Maximum für die Länge, den GC-Gehalt und die Schmelztemperatur (Tm) der Primer-Paare festlegen. Die maximale Primer-Länge die Sie eingeben können ist 100 Basen. Die Primer Tm wird unter Verwendung des Nearest-Neighbor Modells von Borer berechnet. Desweiteren wird die Thermodynamik bei DNA Wechselwirkungen sowie die Salzabhängigkeit von Oligonukleotiden nach SantaLucia ermittelt [Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 95; 1460-1465 (1986)].

Amplikon Kriterien
Für die PCR Produkte können Sie den Bereich der Produktgröße definieren, sowie Minimum und Maximum des GC-Gehalts und der Schmelztemperatur des PCR Produkts. Die maximal Produktgröße beträgt 5.000 bp. Die Tm Berechnung der PCR Produkte beruht auf der Formel von Baldino, et al. [in Methods Enzymol. 168; 761-777 (1989)] die ein wenig von Rychlik, et al. [Nucleic Acids Res. 18; 6409-6412 (1990)] modifiziert wurde.

Reaktionsbedingungen
Die Salzkonzentration spezifiziert die Salzkonzentration in mM in der Reaktion. Dieser Wert wird für die Berechnung der Schmelztemperatur für die Primer und der PCR Produkte verwendet. Der Standardwert beträgt 50.0, kann aber im Bereich von 0.1 to 50.0 mM liegen.
Die Primerkonzentration spezifiziert die DNA Konzentration der Primer in nM in der Reaktion. Dieser Wert wird für die Berechnung der Primer Tm verwendet. Der Standardwert beträgt 50.0, kann aber im Bereich von 0.1 to 50.0 mM liegen.

Für eine effiziente Primer-Bindung, vermeidet das Tool das Design von Primer-Sequenzen mit Hang zu extensiven Self-Dimer und Cross-Dimer Bildungen um Sekundärstrukturen und Primer-Dimere zu verhindern.

Klicken Sie auf den "Design Primer" Button um eine Liste geeigneter PCR Primer-Paare zu erhalten. Das Ergebnis beinhaltet für jedes Primer-Paar die empfohlene Annealing-Temperatur.