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Häufig gestellte Fragen zu Produkten und Dienstleistungen

Custom DNA Sequencing

Products & Services

Was sind “Tube Labels” – Wann und warum brauche ich diese?

Tube Labels haben den Vorteil einer sauberen und eindeutigen Beschriftung Ihrer Proben und Primer die Sie uns zur Sequenzierung einsenden.
Sie werden primär für die Identifizierung Ihrer Auftrags- und Kundendaten benötigt, erlauben uns aber zusätzlich eine schnellere und fehlerfreie Bearbeitung Ihrer Proben.

Eine Übersicht welche Labels wann und von wem verwendet wurden erhalten Sie unter "Meine Kits & Labels".

Unsere Tube Lables können kostenlos Online bestellt werden.

Was sind “TubeSeq Labels“?

TubeSeq Labels - vormals Prepaid Barcodes - sind Barcode Etiketten mit denen Sie unseren TubeSeq Service im Voraus bezahlen können. Zusätzlich können Sie diese verwenden um für die Synthese Ihrer Sequenzier-Primer zu bezahlen. 

Sie erhalten lediglich eine Rechnung für alle bestellten TubeSeq Labels und keine weitere Rechnung für die anschließenden Sequenzierreaktionen.

TubeSeq Labels können auch von Kollegen benutzt werden. Den Status, wer diese wann verwendet hat, können Sie unter "Meine Kits & Labels" einsehen.

TubeSeq Labels erhalten Sie online ab einer Bestellmenge von 50 Stück.

Was sind PlateSeq Kits bzw. PlateSeq Coupons?

PlateSeq Kits und PlateSeq Coupons sind die Prepayment Lösungen für unseren PlateSeq Sequenzierservice.

Jeder PlateSeq Kit wird mit einer 96well Platte und den am besten geeigneten Verschlüssen in einer Metallbox geliefert. Für jede Art von Probenmaterial bieten wir Ihnen den passenden PlateSeq Kit.

PlateSeq Coupons sind Code-Nummern die Ihnen in Ihrem Online Account elektronisch zu Verfügung gestellt werden. Diese können Sie verwenden

  • Für weitere Sequenzierreaktionen zusätzlich zu einem unserer PlateSeq Kits
  • Alternative zu unserem PlateSeq Kit für Plasmid DNA, gereinigte PCR Produkte oder premixed Proben zur sofortigen Verwendung

Sie erhalten lediglich eine Rechnung pro Prepaid-Bestellung und keine weitere Rechnung für anstehende PlateSeq Aufträge.

Wie lange werden meine Sequenzierergebnisse gespeichert?

Ihre Sequenzierergebnisse werden nach Fertigstellung 100 Tage lang in Ihrem persönlichem Account gespeichert. Während diesem Zeitraum können Sie Ihre Daten herunterladen und abspeichern.

Wie lange werden Proben und Primer aufgehoben?

Alle DNA Proben und synthetisierte Primer werden für 6 Wochen aufbewahrt. In diesem Zeitraum haben Sie die Möglichkeit weitere Sequenzierreaktionen nachzubestellen.

Premixed Proben (DNA mit Primer vorgemischt), Proben für den Ready2Load Service und Primer die Sie uns senden werden 3 Tage nach Abschluß des Auftrags verworfen.

Kann ich shRNA oder DNA mit Sekundärstrukturen einsenden?

Ja, wir akzeptieren DNA-Proben mit schwierigeren Sequenzen. Wählen Sie dafür unseren TubeSeq Service oder PlateSeq Service in Kompination mit dem Power Read Upgrade aus.

 

Kann ich Phagen- oder genomische DNA einsenden?

Bitte kontaktieren Sie unseren Customer Support für eine detaillierte Beratung.

How to order

Wie kann ich DNA Sequenzierung bei Eurofins bestellen?

Wir empfehlen als einfachste und komfortabelste Möglichkeit über unseren Online Shop zu bestellen. Im Bestell-Menü finden Sie alle Links zu den entsprechenden Bestellseiten.

Für den Mix2Seq Service bestellen Sie lediglich den Mix2Seq Kit online. Für die Sequenzierung schicken Sie uns lediglich die Proben ohne weiterer Online-Bestellung.

Informationen zur Probenvorbereitung und Probenhandhabung für die einzelnen Services finden Sie auf der jeweiligen Produktseite unter „Probenvorbereitung”.

An welche Adresse sende ich meine Sequenzierproben?

Eurofins Genomics hat zur kostenlosen Probenabholung bereits hunderte DropBoxen in Europa installiert. Den Standort Ihrer nächstgelgenen DropBox mit entsprechender Abholzeit können Sie in Ihrem Account einsehen, sofern Sie eingleoggt sind. 

Falls sich keine Eurofins Dropbox in Ihrer Nähe befinden sollte, senden Sie Ihre Proben und Primer bitte an folgende Adresse:  

Eurofins Genomics
Sequencing Department
Anzinger Str. 7a
85560 Ebersberg
Germany

Umschläge und Etiketten für Post und DHL Versand erhalten Sie unter Probenversand

 

Kann ich mehrere Reaktionen pro Probe bestellen?

Ja, unabhängig von der Probenart, können Sie mit unserem TubeSeq Service bis zu 8 Reaktionen pro Template definieren. Für Proben in Platte können Sie mit unserem PlateSeq Service bis zu 4 Reaktionen pro Template (= pro Well) für die gesamte Platte spezifizieren.

 

Wie viele Platten kann ich pro Auftrag einsenden?

Sie können bis zu 15 Platten auf einmal hochladen bzw. einzeln eingeben und im Warenkorb speichern. Es gibt keine Maximalmenge pro Auftrag.

 

Kann ich Sequenzierreaktionen nachbestellen?

Neue Sequenzierreaktionen mit gelagerter DNA können innerhalb der Aufbewahrungszeit von 6 Wochen bestellt werden.

Wenn Sie Ihre Proben in Tubes gesendet hatten, gehen Sie dazu einfach auf die TubeSeq Service Bestellseite und geben die Anfangsbuchstaben der entsprechenden DNA ein. Das System listet Ihnen alle gelagerten Proben, die mit diesen Anfangsbuchstaben beginnen auf.

Falls Sie neue Reaktionen für vereinzelte Proben aus einer Platte nachbestellen wollen, wählen Sie ebenfalls die TubeSeq Service Bestellseite sowie den Namen der gelagerten Platte. Selektieren Sie aus dieser Platte die entsprechenden Proben und spezifizieren Sie dafür die neuen Reaktionen.

Um neue Reaktionen für mehr als 48 Proben aus einer Platte zu bestellen, nutzen Sie bitte die PlateSeq Service Bestellseite.

Das Enddatum der Aufbewahrungszeit Ihrer DNA Proben finden Sie in Ihrem Account unter "Meine Proben & Primer".

 

Sample Preparation

Wie soll ich meine Sequenzierproben einsenden?

Sie finden alle Informationen bezüglich Probenaufbereitung, DNA- und Primerkonzentration sowie Transportempfehlungen auf den jeweiligen Produktseiten unter "Probenversand”.

Wie ermittle ich die Konzentration meiner Probe(n)?

Ermitteln Sie die optische Dichte (OD) mit einem Spektrophotometer bei 260nm und 280nm.

Um reproduzierbare und zuverlässige Ergebnisse zu erzielen, sollte der OD260-Wert zwischen 0,05 und 0,8 liegen. Das OD 260/280-Verhältnis sollte 1,8 sein. Werte unter 1,6 bzw. höher als 2,0 sind ein Hinweis auf Kontaminationen in der Probe, die die Konzentrationsbestimmung negativ beeinflussen und höchstwahrscheinlich zu schlechten Sequenzierergebnissen führen.

Wir empfehlen zusätzlich eine OD-Messung bei 230nm und 320nm. Ein hoher OD320-Wert deutet eine eventuelle Kontamination an. Der Wert sollte idealerweise bei 0,0 liegen. Das OD 230/260-Verhältnis sollte kleiner als 0,6 sein.

Um sich der Qualität Ihrer DNA ganz sicher zu sein, empfehlen wir eine zusätzliche Kontrolle mittels Agarosegel.

Welche Aufreinigungsmethode(n) soll ich verwenden?

Für Plasmide empfehlen wir kommerziell erhältliche Mini Scale Präparations-Kits. Erfahrungsgemäß wird die DNA-Qualität und somit das Sequenzierergebnis verbessert, wenn der Waschschritt wiederholt wird.
Bitte senden Sie keine DNA, die mit Hilfe alkalischer Lyse oder Boiling-Methode nach Holmes und Quigley, 1981 ohne anschließende Säulchenreinigung isoliert wurde.

Für PCR-Produkte sollten kommerziell erhältliche PCR-Aufreinigung „Spin Column Kits“ verwendet werden.

Kann ich meine DNA in Tris-EDTA (TE) einsenden?

Nein, bitte nicht.

EDTA bindet bivalente Kationen wie Magnesium (Mg++), die essentiell für die Taq-Polymerase sind. DNA ist über mehrere Tage in bi-destilliertem Wasser oder Tris-HCl bei Raumtemperatur stabil. In getrocknetem Zustand ist DNA sogar noch länger haltbar. Falls Sie Ihre DNA trotzdem in Tris-EDTA lagern möchten, entnehmen Sie vorab ein Aliquot des Eluats und senden dieses an unsere Sequenzierabteilung.

Sollte ich meine DNA auf Trockeneis versenden?

Das ist nicht notwendig; DNA ist über mehrere Tage in bi-destilliertem Wasser oder Tris-HCl bei Raumtemperatur stabil. Bitte lösen Sie Ihre DNA keinesfalls in Tris-EDTA, da dies negative Auswirkung auf die Taq-Polymerase hat.

Kann ich ungereinigte PCR-Produkte oder Klone einsenden?

Ja.

Wir bieten für alle Custom Sequencing Services DNA-Präparationen und PCR-Produktaufreinigungen als zusätzliche Dienstleistung an. 

Welche E.coli Stämme soll ich verwenden?

Obwohl der verwendete Stamm signifikanten Einfluss auf die DNA-Qualität haben kann, sind die meisten E.coli Stämme zur DNA-Isolierung geeignet.

Bakterienstämme wie DH10b, DH5 alpha, XL10 Gold und TOP10 liefern in Kombination mit vielen der kommerziell erhältlichen DNA-Präparations-Kits in der Regel eine hohe DNA-Qualität und gelten daher für die Plasmid-Sequenzierung als sehr geeignet.

Eine schlechtere DNA-Qualität liefern Stämme, die hohe Mengen an Kohlehydraten produzieren, welche dann während der Lyse freigesetzt werden und Enzymaktivitäten blockieren. Beispiele sind HB101 und dessen Derivate wie beispielsweise TG1 und die JM100 Serie.
Auch Stämme mit mittleren oder hohen Endonukleaseaktivitäten wie beispielsweise der HB101, JM101 oder BL21 produzieren DNA mit geringerer Qualität. In diesem Fall sollte eine Proteinase-K-Behandlung in Betracht gezogen werden.

Ist es notwendig mein PCR-Produkt aufzureinigen, wenn nur eine Bande zu sehen ist?

Das Produkt muss von Primer- und dNTP Rückständen befreit sein. Vorhandene Primerrückstände führen zu Mischsequenzen – bereits ein fünfprozentiger Anteil an Primer führt bereits zu unleserlichen Mischsequenzen. Die dNTPs würden die dNTP/ddNTP-Konzentration in der Sequenzierreaktion beeinflussen. Wir empfehlen daher die Aufreinigung mit kommerziell erhältlichen PCR-Aufreinigungs- „Spin Column“ Kits“.

Ich sehe unspezifische Banden in meiner PCR-Reaktion. Sollte ich mein Produkt über ein Gel aufreinigen?

Falls Sie Ihren PCR-Primer in der Sequenzierreaktion verwenden wollen, ist es notwendig Ihr PCR-Produkt über ein Agarose-Gel aufzureinigen. Andernfalls erhalten Sie eine Mischsequenz, da sich Ihr Primer höchstwahrscheinlich an beide Produkte, d.h. sowohl dem spezifischen als auch dem unspezifischen, binden wird.
Wenn Sie einen spezifischen Nested Primer für die Sequenzierung einsetzen wollen, könnte das auch ohne vorherige Aufreinigung funktionieren.
Die beste Garantie für ein gutes Sequenzierergebnis ist allerdings nach wie vor, dass sich nur ein Produkt in der PCR-Reaktion befindet. Um unspezifische PCR-Produkte zu vermeiden, hilft es bereits in den meisten Fällen die PCR-Konditionen anzupassen (z.B. Primer-Design, höhere Annealing-Temperatur und/oder geringere Primer Konzentration).

Primers & More

Welche Standard Primer bietet Eurofins Genomics an?

Mehr als 80 verschiedene Standard Primer stehen Ihnen für Ihre DNA Sequenzierung zur Verfügung. Hier finden Sie die komplette Liste der kostenlosen Standard Primer.

Kann ich meine eigenen Sequenzierprimer senden?

Ja. Geben Sie einfach den Namen und die Sequenz des Primers den Sie uns senden wollen auf der Bestellseite mit ein. 

Die nötigen Volumen und Konzentrationsangaben finden Sie unter “Probenvorbereitung” auf unserer Website.

Kann Eurofins Genomics Primer für mich synthetisieren? Wie bestelle ich diesen Service?

Ja. Geben Sie den Namen und die Sequenz des Primers, den Sie bei uns synthetisieren lassen wollen, unter "Order a Primer" bei Ihrer Sequenzierbestellung mit an.

Bitte beachten Sie, dass wir diese Primer 6 Wochen lang für Sie lagern, sodass Sie innerhalb dieses Zeitraums einzelne Sequenzierungen mit diesem Primer nachbestellen können.

Wie und in welcher Konzentration kann ich meine Primer senden?

Die entsprechenden Angaben zu Primer Konzentrationen und Lösungsvolumina finden Sie auf den jeweiligen Produktseiten unter "Probenvorbereitung".

Technical Questions

Was ist eine BLASTx-Analyse? Welche Daten erhalte ich?

BLAST (Abk. für engl. Basic Local Alignment Search Tool) ist der Überbegriff für eine Sammlung der weltweit am häufigsten genutzten Programme zur Analyse biologischer Sequenzdaten.
Mit BLASTx werden experimentell ermittelte DNA-Sequenzen mit bereits vorhandenen Sequenzen verglichen, die in der nicht redundanten Protein-Datenbank von NCBI abgelegt sind. Dieser Service wird verwendet, um eine potentielle Translation einer unbekannten Nukleotidsequenz zu finden.

Was ist der IUPAC Code? Welche Ergebnisse erhalte ich?

Die DNA-Basenidentifikation beruht auf der Nomenklatur, die von der International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) ausgegeben wurde. Bei nicht eindeutiger Basenidentifikation werden folgende IUPAC-Codes verwendet:

G/T = K C/T = Y A/C/G = V
A/G = R A/C = M C/T/G/ = B
G/C = S A/G/T = D A/C/G/T = N
A/T = W A/C/T = H

Was ist die Platten-Ergebnisübersicht (plate result summary)?

Die “plate result summary” ist eine Übersicht über die Ergebnisse aller sequenzierten Proben pro Platte. Diese beinhaltet in entsprechender Reihenfolge den Namen der jeweiligen Probe und deren Wellposition, die Leselänge nach dem Quality Clip, die Positionen der Quality Clips und den Qualitätswert der gesamten Sequenz.

Was sind Q20 (Q30 / Q40) Basen?

Eurofins Genomics verwendet ein Basecalling-Programm, dass jeden Peak jeder Base einzeln untersucht und anhand dessen an jede Base einen Qualitätswert (Q) vergibt. Qualitätswerte variieren im Bereich von 4 bis ca. 60, je höher der Wert, desto höher die Qualität.

Die Qualitätswerte haben einen logarithmischen Bezug zu Fehlerwahrscheinlichkeiten in der Sequenz. Eine Aufstellung sehen Sie in folgender Tabelle:

QualitätswertWahrscheinlichkeit einer falsch gelesenen BaseSequenzgenauigkeit
Q 10 1 in 10 90 %
Q 20 1 in 100 99 %
Q 30 1 in 1.000 99.9 %
Q 40 1 in 10.000 99.99 %
Q 50 1 in 100.000 99.999 %

Welche Sequenziermethode setzt Eurofins Genomics ein?

Für alle Custom Sequencing Services setzen wir die Cycle Sequencing Technologie (dideoxy chain termination / cycle sequencing) auf ABI 3730XL-Sequenzern ein.

Was ist die „Cycle Sequencing“ Technik?

Cycle-Sequencing, ist eine Modifikation der traditionellen Sanger-Sequenziermethode. Die Komponenten sind DNA, Primer, hitzebeständige DNA-Polymerase, 4 dNTP´s, 4 ddNTP´s (dideoxy terminator nucleotides) fluoreszenzmarkiert mit vier verschiedenen Farbstoffen sowie Puffer mit MG++ und K+-Ionen. Der einzelne Primer bindet an den komplementären DNA-Strang und wird in linearer Form verlängert. Diese Verlängerung wird so lange fortgeführt, bis zufälligerweise und abhängig von der komplementären Base ein bestimmtes ddNTP gekoppelt wird. Bedingt durch die Dideoxy-Beschaffenheit kann die Polymerase keine weitere Base mehr an diesem Fragment anfügen und die Verlängerung bricht ab.

Auf diese Weise erhält man am Ende einer definierten Anzahl an Zyklen eine Vielzahl an Fragmenten mit verschiedenen Längen und farbstoffmarkierten Enden.

Die stöchiometrische Beeinflussung der einzelnen Reaktionskomponenten stellt sicher, dass Fragmente jeder möglichen Länge generiert werden. Angenommen es werden 2.000 Basen generiert, dann erhalten wir alle Fragmente angefangen von n+1 bis 2.000, wenn n die Anzahl der Basen im Primer ist.

Der Hauptunterschied zwischen der traditionellen Sanger-Methode und der Cycle-Sequencing-Methode ist die Einführung der thermostabilen DNA-Polymerase. Der Vorteil dieser Polymerase ist, dass die Sequenzierreaktion immer wieder in demselben Tube wiederholt werden kann. Dabei wird das Reaktionsgemisch im Wechsel erhitzt und abgekühlt, einerseits um die DNA zu denaturieren und anderseits zum Annealen des Primers, um neue Sequenzketten zu bilden.

Aus diesem Grund wird weniger Template-DNA benötigt als bei konventionellen Sequenzierreaktionen.

Nach der Aufreinigung der Sequenzierreaktionen werden die Proben elektrokinetisch in die Kapillaren des 96-Kapillarsequenzierers injiziert.

Die negativ geladenen Fragmente wandern der Größe nach geordnet die Anode entlang, wobei die kleinsten Fragmente am schnellsten sind. Durch ihre angehängten ddNTP-Terminatoren kann die Basensequenz des Fragments gelesen werden.

Ein Laserstrahl regt in dem Moment, in dem die Fragmente das Detektionsfenster erreichen diese Farbstoffmoleküle an und produziert somit Fluoreszenzsignale. Diese Signale werden von allen 96 Kapillaren gleichzeitig gesammelt, spektral voneinander getrennt und auf eine CCD (charge-coupled device) Kamera fokussiert.

Äußerst hochentwickelte optische und elektronische Apparate produzieren ein farbiges Schema, das mit Hilfe einer Sequenzanalysesoftware in eine lesbare Sequenz übersetzt wird.

Was ist der Qualitätsreport?

In dem Qualitätsreport (*.pdf Format) bestehend aus den ABI-Trace-Dateien werden die Qualitätswerte jeder einzelnen Base farbig unterhalb jedes Peaks dargestellt. Jede der vier verschiedenen Farben repräsentiert jeweils einen spezifizierten Qualitätsbereich.

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