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Häufig gestellte Fragen zu Produkten und Dienstleistungen


Was ist eine Mate-Pair-Bibliothek?

Die Mate-Pair-Bibliothek besteht aus Fragmenten von 150-300 bp. Die Fragmente bestehen aus 2 DNA-Fragmenten, die im untersuchten Genom ursprünglich 2-5 kbp entfernt liegen. Mit dieser Bibliothek können daher Lücken oder repetitive Bereiche von 2-5 kbp überbrückt werden.

Für die Herstellung der Bibliothek wird die genomische DNA zunächst fragmentiert und Fragmente von ca. 3.5 kbp isoliert (siehe Abbildung). Die Fragment-Enden werden daraufhin mit Biotin markiert und die Fragmente werden zirkularisiert. Die zirkularisierten Moleküle werden erneut fragmentiert und Biotin-markierte Fragmente werden angereichert. Die Sequenzierung der Biotin-markierten Fragmente generiert die gewünschten 'Outward-Facing' Read-Paare: Hierbei alinieren beide Reads nach außen gerichtet auf die Referenzsequenz. Die Entfernung beider Reads auf der Referenz liegt dabei zwischen 2 und 5 kbp.

Einige Punkte limitieren den Nutzen der Mate-Pair-Bibliotheken für ein qualitativ hochwertiges Scaffolding von Contigs.

1) 'Inward-Facing' Read-Paare: Die Sequenzierung von nicht markierten Fragmenten, die nicht erfolgreich weggewaschen wurden, produziert sogenannte Inward-Facing Reads (siehe Illumina’s Mate-Pair Sample Preparation Guide). Die Inward-Facing Reads verhalten sich wie Shotgun Paired-End Reads, da sie mit einer Spannweite von ca. 200-300 bp auf die Referenzsequenz alinieren.

2) Die Fragmentierung der zirkularisierten und Biotin-markierten Moleküle ist ein mechanischer Prozess und produziert daher Fragmente, die die Biotin-Markierung entweder in der Mitte des Fragments oder an einer anderen Position im Fragment tragen. Die Sequenzierung von Fragmenten, die die Biotin-Markierung in der Mitte des Fragments tragen, generiert die gewünschten 'Outward-Facing' Read-Paare. Wenn jedoch ein Fragment sequenziert wird, welches die Biotinmarkierung innerhalb der jeweils äußeren 100 bp des Fragments trägt, ist jeweils einer der beiden resultierenden Reads chimär. Der chimäre Read enthält Sequenzinformation von BEIDEN Seiten des ursprünglichen 3.5 kbp Fragments und es gibt keinerlei Anhaltspunkt darüber, an welcher Position in dem Read die Fusionsstelle liegt. Derartige Read-Paare sind für die Assemblierung wertlos und können sogar zu falschen Assemblierungen führen.

Für qualitativ hochwertiges Scaffolding mit Illumina HiSeq 2000 bietet Eurofins Genomics eine proprietäre Bibliothek als Alternative an, die sogenannte Long-Jumping-Distance-Bibliothek mit Spannweiten von 3kbp, 8 kbp, 20 kbp und sogar 40 kbp. Weiterlesen

 

 

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