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Häufig gestellte Fragen zu Produkten und Dienstleistungen



Wie viel Probenmaterial wird für die Genom Sequenzierung benötigt?

2-5 µg genomische DNA werden für die Shotgun Sequenzierung auf dem Illumina HiSeq 2500 / MiSeq benötigt.

Für die Herstellung und Sequenzierung von LJD-Bibliotheken mit Insertgrößen von 3 kb, 8 kb, 20 kb und 40 kb benötigen wir zusätzlich 5 µg, 15 µg, 30 µg oder 50 µg genomische DNA.

Wir empfehlen Ihnen wenn möglich mehr DNA-Material zu senden, um weitere Qualitätskontrollen und gegebenenfalls Wiederholungen durchführen zu können.

Was bedeutet Coverage Sequenzierung?

Bei der Coverage Sequenzierung wird die DNA so lange sequenziert, bis eine bestimmte Menge an Sequenz-Information - und somit eine bestimmte Abdeckung der Sequenz - erreicht ist.

Beispiel:

  • Für eine einfache Coverage eines Genoms von 3 Mb müssen 3 Millionen Basenpaare sequenziert werden.
  • Für eine 6-fache Coverage ist die Sequenzierung von 18 Millionen Basenpaaren nötig.


Für die Sequenzierung auf Illumina HiSeq 2500 empfehlen wir eine 30-50-fache Coverage.

Wie lange ist die Lieferzeit?

Die Lieferzeit hängt vom Organismus und Ihren Anforderungen ab.

Für die Coverage-Sequenzierung eines bakteriellen Genoms (z.B. E. coli mit 4,6 Mb) beträgt die Lieferzeit nur wenige Wochen.

Wie werden die Daten ausgeliefert?

In Abhängigkeit der Datenmenge versenden wir Ihre Sequenzdaten auf DVDs, USB-Sticks oder Festplatten.

Zusätzlich haben sie die Möglichkeit Ihre Daten von unserem "secure FTP" Server herunterzuladen.

Wie werden die Assemblierung und das Scaffolding durchgeführt?

Bei der Assemblierung werden einzelne überlappende Reads zu längeren Contigs assembliert.
Diese sind zunächst nicht geordnet. Durch das Scaffolding werden die Anordnung und die Orientierung der Contigs bestimmt. Dies kann beispielsweise durch die Sequenzierung von Long Jumping Distance (LJD) -Banken auf einem Illumina Instrument erreicht werden. Dabei werden Paare aus 2 kurzen Sequenzfragmenten erzeugt, die im Genom 3 kbp, 8 kbp, 20 kbp oder 40 kbp voneinander entfernt liegen.

Beim Scaffolding-Prozess werden die LPE-Reads unter Berücksichtigung der ursprünglichen Entfernung mit den Contigs assembliert. Dadurch werden die Contigs angeordnet.

Was ist eine Mate-Pair-Bibliothek?

Die Mate-Pair-Bibliothek besteht aus Fragmenten von 150-300 bp. Die Fragmente bestehen aus 2 DNA-Fragmenten, die im untersuchten Genom ursprünglich 2-5 kbp entfernt liegen. Mit dieser Bibliothek können daher Lücken oder repetitive Bereiche von 2-5 kbp überbrückt werden.

Für die Herstellung der Bibliothek wird die genomische DNA zunächst fragmentiert und Fragmente von ca. 3.5 kbp isoliert (siehe Abbildung). Die Fragment-Enden werden daraufhin mit Biotin markiert und die Fragmente werden zirkularisiert. Die zirkularisierten Moleküle werden erneut fragmentiert und Biotin-markierte Fragmente werden angereichert. Die Sequenzierung der Biotin-markierten Fragmente generiert die gewünschten 'Outward-Facing' Read-Paare: Hierbei alinieren beide Reads nach außen gerichtet auf die Referenzsequenz. Die Entfernung beider Reads auf der Referenz liegt dabei zwischen 2 und 5 kbp.

Einige Punkte limitieren den Nutzen der Mate-Pair-Bibliotheken für ein qualitativ hochwertiges Scaffolding von Contigs.

1) 'Inward-Facing' Read-Paare: Die Sequenzierung von nicht markierten Fragmenten, die nicht erfolgreich weggewaschen wurden, produziert sogenannte Inward-Facing Reads (siehe Illumina’s Mate-Pair Sample Preparation Guide). Die Inward-Facing Reads verhalten sich wie Shotgun Paired-End Reads, da sie mit einer Spannweite von ca. 200-300 bp auf die Referenzsequenz alinieren.

2) Die Fragmentierung der zirkularisierten und Biotin-markierten Moleküle ist ein mechanischer Prozess und produziert daher Fragmente, die die Biotin-Markierung entweder in der Mitte des Fragments oder an einer anderen Position im Fragment tragen. Die Sequenzierung von Fragmenten, die die Biotin-Markierung in der Mitte des Fragments tragen, generiert die gewünschten 'Outward-Facing' Read-Paare. Wenn jedoch ein Fragment sequenziert wird, welches die Biotinmarkierung innerhalb der jeweils äußeren 100 bp des Fragments trägt, ist jeweils einer der beiden resultierenden Reads chimär. Der chimäre Read enthält Sequenzinformation von BEIDEN Seiten des ursprünglichen 3.5 kbp Fragments und es gibt keinerlei Anhaltspunkt darüber, an welcher Position in dem Read die Fusionsstelle liegt. Derartige Read-Paare sind für die Assemblierung wertlos und können sogar zu falschen Assemblierungen führen.

Für qualitativ hochwertiges Scaffolding mit Illumina HiSeq 2000 bietet Eurofins Genomics eine proprietäre Bibliothek als Alternative an, die sogenannte Long-Jumping-Distance-Bibliothek mit Spannweiten von 3kbp, 8 kbp, 20 kbp und sogar 40 kbp. Weiterlesen

 

 

Was ist eine Long-Jumping-Distance (LJD)-Bibliothek?

Long-Jumping-Distance (LJD)-Bibliotheken wurden von Eurofins Genomics entwickelt, um Scaffolding von Contigs im hohen Durchsatz zu ermöglichen. Die LJD-Bibliothek ist an die Sequenzierung mit dem Illumina HiSeq 2000 und dem Illumina MiSeq angepasst. Während die Mate-Pair-Bibliothek Spannweiten von 2 -5 kbp aufweist, weisen die LJD-Bibliotheken weit präzisere Spannweiten auf, welche die Assemblierung wesentlich verbessern. LJD-Bibliotheken werden mit Spannweiten von 3kbp, 8 kbp, 20 kbp und sogar 40 kbp angeboten.

Die LJD-Bibliothek weist gegenüber der Mate-Pair-Bibliothek weitere Vorteile auf. Zum einen ist aufgrund von Unterschieden in der Bibliothek-Herstellung der Anteil Shotgun Paired-End Reads stark reduziert. Nur ungefähr 1% der LJD reads sind Shotgun Paired-End Reads. Des Weiteren sind bei der LJD Bibliothek die beiden Sequenzen des ursprünglich 3 kbp, 8 kbp, 20kbp oder 40 kbp langen Fragments durch einen Adaptor voneinander getrennt. Hybrid-Reads, wie sie bei der Mate-Pair-Bibliothek vorkommen (siehe Erklärung in der Mate-Pair FAQ), sind bei der LJD Bibliothek also fast vollkommen ausgeschlossen. Die Fusionsstelle beider Sequenzen ist durch den Adaptor definiert.

 

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