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PROD | u6.1.6
 

 

Häufig gestellte Fragen zu Produkten und Dienstleistungen


Prinzip der Illumina Sequenziertechnologie

Bei der Illumina HiSeq 2000 / MiSeq Technologie werden die zu sequenzierenden DNA-Fragmente zunächst mit der sogenannten Brücken-PCR (Bridge-PCR) amplifiziert. Die Sequenziertechnologie basiert auf dem Einsatz reversibler Farbstoff-Terminatoren.

Bei der Brücken-PCR werden die DNA-Matrizen und Primer an eine zweidimensionale Oberfläche immobilisiert. Die Primer sind so konzipiert, dass sie an die Adaptoren der DNA-Fragmente hybridisieren. In jedem PCR-Zyklus binden die DNA-Fragmente daher an die Primer in der Umgebung und bilden sogenannte Brücken aus. Durch den nachfolgenden Denaturierungsschritt entstehen wieder einzelsträngige, auf der Oberfläche verankerte DNA-Fragmente (Cluster). Für die Sequenzierung der Cluster wird ein universeller Primer an die Adaptoren der DNA-Fragmente hybridisiert.

faq 9.1

Die Sequenzierung der generierten Cluster erfolgt durch die Replikation des komplementären Strangs mit reversiblen Farbstoff-Terminatoren. Dieses sind Desoxynukleotide, die ein Fluorophor und eine Blockierungsgruppe tragen. An die 4 Nukleotide sind jeweils unterschiedliche Fluorophore gebunden. Da die Blockierungsgruppe die DNA-Synthese abbricht, wird der Strang jeweils nur um ein markiertes Nukleotid verlängert. Die Oberfläche wird anschließend gewaschen, um nicht eingebaute Nukleotide zu entfernen. Um die Identität des eingebauten Nukleotids zu identifizieren, wird das Fluoreszenzsignal analysiert. Im Anschluss wird das Fluorophor und die Blockierungsgruppe von dem Nukleotid abgespalten. Die entstehenden vierfarbigen Bilder werden für die Sequenzbestimmung genutzt.

faq 9.2

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