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Häufig gestellte Fragen zu Produkten und Dienstleistungen

Next Generation Sequencing

Allgemeine & Technische Fragen

Welche Dienstleistungen bietet Eurofins Genomics im Bereich Next Generation Sequenzierung an?

Genom-Sequenzierung

  • De novo Sequenzierung von Pilzgenomen
  • De novo Sequenzierung von höheren, eukaryotischen Genomen
  • De novo Sequenzierung von BACs, Viren & Plasmiden
  • Resequenzierung von Genomen

Transkriptom Sequenzierung

  • De novo Transkriptom-Sequenzierung
  • Expression profiling

Resequenzierung & Amplikons

  • Ultratiefe Amplikon-Sequenzierung
  • Resequenzierung mit Hilfe von Sequence Capture
  • Exom-Sequenzierung

Bioinformatik & Spezial Services

  • Bioinformatische Lösungen
    wie zum Beispiel den novo Assembly, Mapping, Amplikonvarianzanalyse ...
  • Banken-Service
  • Proben-Aufreinigung
  • NGS Favourites

Wie kann ich Next Generation Sequenzierung bestellen?

Jedes Next Generation Sequenzierungsprojekt wird in der Regel individuell mit unseren Kunden abgestimmt.

Bitte schicken Sie uns zunächst eine Angebotsanfrage.

Wir arbeiten daraufhin mit Ihnen das Projekt-Layout aus.

Wohin schicke ich meine Proben?

Bitte senden Sie Ihre Proben zusammen mit Ihrem unterschriebenen Angebot an folgende Adresse:

Eurofins Genomics
NGS - Laboratory
Anzinger Str. 7a
85560 Ebersberg
Germany

Wo kann ich mehr über die verschiedenen Sequenziertechnologien erfahren?

Illumina:

Zusätzliche Informationen von Illumina über die Sequenziertechnologie des HiSeq 2500 und des MiSeq finden Sie unter

http://www.illumina.com/applications/sequencing/dna_sequencing.html.

PacBio RS:

Zusätzliche Informationen von PacBio Applied Science über die Sequenziertechnologie des PacBio RS finden Sie unter http://www.pacificbiosciences.com/products/.

Was ist das Prinzip der Illumina HiSeq 2000 Sequenziertechnologie?

Bei der Illumina HiSeq 2000 / MiSeq Technologie werden die zu sequenzierenden DNA-Fragmente zunächst mit der sogenannten Brücken-PCR (Bridge-PCR) amplifiziert. Die Sequenziertechnologie basiert auf dem Einsatz reversibler Farbstoff-Terminatoren.

Bei der Brücken-PCR werden die DNA-Matrizen und Primer an eine zweidimensionale Oberfläche immobilisiert. Die Primer sind so konzipiert, dass sie an die Adaptoren der DNA-Fragmente hybridisieren. In jedem PCR-Zyklus binden die DNA-Fragmente daher an die Primer in der Umgebung und bilden sogenannte Brücken aus. Durch den nachfolgenden Denaturierungsschritt entstehen wieder einzelsträngige, auf der Oberfläche verankerte DNA-Fragmente (Cluster). Für die Sequenzierung der Cluster wird ein universeller Primer an die Adaptoren der DNA-Fragmente hybridisiert.

faq 9.1

Die Sequenzierung der generierten Cluster erfolgt durch die Replikation des komplementären Strangs mit reversiblen Farbstoff-Terminatoren. Dieses sind Desoxynukleotide, die ein Fluorophor und eine Blockierungsgruppe tragen. An die 4 Nukleotide sind jeweils unterschiedliche Fluorophore gebunden. Da die Blockierungsgruppe die DNA-Synthese abbricht, wird der Strang jeweils nur um ein markiertes Nukleotid verlängert. Die Oberfläche wird anschließend gewaschen, um nicht eingebaute Nukleotide zu entfernen. Um die Identität des eingebauten Nukleotids zu identifizieren, wird das Fluoreszenzsignal analysiert. Im Anschluss wird das Fluorophor und die Blockierungsgruppe von dem Nukleotid abgespalten. Die entstehenden vierfarbigen Bilder werden für die Sequenzbestimmung genutzt.

faq 9.2

Auf welche Art können bei der Illumina HiSeq 2500 Sequenzierung die entstehenden Datenmengen an meine Erfordernisse angepasst werden?

Die Flow Cells des Hochdurchsatzmoduls des HiSeq 2500 Instruments sind physikalisch in 8 Kanäle unterteilt. In einem Kanal können bis zu 180 Millionen Cluster von einem oder beiden Enden ansequenziert werden.

Aufgrund der enormen generierten Datenmengen empfehlen wir oft, mehrere Proben parallel in einem Kanal zu sequenzieren. Dazu nutzen wir molekulare Barcodes (Abfolgen spezifischer Nukleotide), um bis zu 12 einzelne Proben in einem HiSeq 2000 Kanal spezifisch zu markieren. Dieses Multiplex-Verfahren ist für die meisten Anwendungen, wie z.B. die mRNA-Sequenzierung oder ChIP-Seq einsetzbar.

Können Sie DNA mit hohem GC-Gehalt oder DNA mit Sekundär- oder Hairpin- Strukturensequenzieren?

Ja, die Sequenzierung mit dem HiSeq 2500 ist ideal für die Sequenzierung von DNA mit hohem GC-Gehalt, da es zu keinen Abbrüchen kommt. Ein hoher oder niedriger GC-Gehalt erschwert allerdings die de novo Assemblierung von Genomen. In diesen Fällen erhält man die besten Assemblierungsergebnisse, wenn eine Kombination aus einer Shotgun und LJD-Bibliotheken sequenziert wird.

Bitte kontaktieren Sie uns bezüglich des Designs der besten Sequenzierstrategie >

Welche Daten liefern Sie für Illumina HiSeq and MiSeq Projekte aus?

Für Projekte mit dem Illumina HiSeq oder MiSeq erhalten Sie von uns die FASTQ Dateien jedes einzelnen Reads. Die Intensitätswerte und Bilddateien werden während des Laufs automatisch gelöscht und können nicht mitgeliefert werden.

Verfügen Sie über Referenzen für Next Generation Sequenzierung?

Ja wir haben Referenzkunden für alle NGS Anwendungen. Eine Auswahl einiger Publikationen finden sie hier.

Falls Sie eine Referenz für eine spezifische Anwendung benötigen, können Sie uns auch einfach unter genseq-eu@eurofins.com kontaktieren.

Wie liefere ich eine Referenz-Sequenz?

Bitten senden Sie uns die Sequenz in Form eines FASTA- oder NCBI-Files oder übermitteln Sie uns die exakte Referenzsequenz.

Bitte liefern Sie uns die Referenzsequenz per E-Mail an genseq-eu@eurofins.com oder an Ihre Kontaktperson aus dem Vertrieb.

Kann ich eine Vertraulichkeitsvereinbarung erhalten (CDA / NDA)?

Ja. Wir halten entsprechende Vorlagen für Sie bereit. In der Regel sind wir auch gerne bereit, Ihre Vorlage zu verwenden.

Selbstverständlich verpflichten wir uns in unseren Angeboten und allgemeinen Geschäftsbedingungen, Ihre Projekte höchst vertraulich zu behandeln.

Besitze ich das Eigentumsrecht (Intellectual Property) an meinen Daten?

Ja. Als Dienstleistungsunternehmen erheben wir keinerlei Ansprüche auf das geistige Eigentum der von uns bearbeiteten Projekte.

Was sind die NGS Favourites?

Unsere NGS Favourites sind vor-definierte Lösungen spezielle NGS Anwendungen. Diese Pakete sind durch unsere langjährige Erfahrung im Bereich NGS enstanden.

Unsere NGS Favourites können sie ganz bequem online bestellen.

Mehr Informationen zu unseren NGS Favourites finden Sie hier.

Fragen zur Genom-Sequenzierung

Wie viel Probenmaterial wird für die Genom Sequenzierung benötigt?

2-5 µg genomische DNA werden für die Shotgun Sequenzierung auf dem Illumina HiSeq 2500 / MiSeq benötigt.

Für die Herstellung und Sequenzierung von LJD-Bibliotheken mit Insertgrößen von 3 kb, 8 kb, 20 kb und 40 kb benötigen wir zusätzlich 5 µg, 15 µg, 30 µg oder 50 µg genomische DNA.

Wir empfehlen Ihnen wenn möglich mehr DNA-Material zu senden, um weitere Qualitätskontrollen und gegebenenfalls Wiederholungen durchführen zu können.

Was bedeutet Coverage Sequenzierung?

Bei der Coverage Sequenzierung wird die DNA so lange sequenziert, bis eine bestimmte Menge an Sequenz-Information - und somit eine bestimmte Abdeckung der Sequenz - erreicht ist.

Beispiel:

  • Für eine einfache Coverage eines Genoms von 3 Mb müssen 3 Millionen Basenpaare sequenziert werden.
  • Für eine 6-fache Coverage ist die Sequenzierung von 18 Millionen Basenpaaren nötig.


Für die Sequenzierung auf Illumina HiSeq 2500 empfehlen wir eine 30-50-fache Coverage.

Wie lange ist die Lieferzeit?

Die Lieferzeit hängt vom Organismus und Ihren Anforderungen ab.

Für die Coverage-Sequenzierung eines bakteriellen Genoms (z.B. E. coli mit 4,6 Mb) beträgt die Lieferzeit nur wenige Wochen.

Wie werden die Daten ausgeliefert?

In Abhängigkeit der Datenmenge versenden wir Ihre Sequenzdaten auf DVDs, USB-Sticks oder Festplatten.

Zusätzlich haben sie die Möglichkeit Ihre Daten von unserem "secure FTP" Server herunterzuladen.

Wie werden die Assemblierung und das Scaffolding durchgeführt?

Bei der Assemblierung werden einzelne überlappende Reads zu längeren Contigs assembliert.
Diese sind zunächst nicht geordnet. Durch das Scaffolding werden die Anordnung und die Orientierung der Contigs bestimmt. Dies kann beispielsweise durch die Sequenzierung von Long Jumping Distance (LJD) -Banken auf einem Illumina Instrument erreicht werden. Dabei werden Paare aus 2 kurzen Sequenzfragmenten erzeugt, die im Genom 3 kbp, 8 kbp, 20 kbp oder 40 kbp voneinander entfernt liegen.

Beim Scaffolding-Prozess werden die LPE-Reads unter Berücksichtigung der ursprünglichen Entfernung mit den Contigs assembliert. Dadurch werden die Contigs angeordnet.

Was ist eine Mate-Pair-Bibliothek?

Die Mate-Pair-Bibliothek besteht aus Fragmenten von 150-300 bp. Die Fragmente bestehen aus 2 DNA-Fragmenten, die im untersuchten Genom ursprünglich 2-5 kbp entfernt liegen. Mit dieser Bibliothek können daher Lücken oder repetitive Bereiche von 2-5 kbp überbrückt werden.

Für die Herstellung der Bibliothek wird die genomische DNA zunächst fragmentiert und Fragmente von ca. 3.5 kbp isoliert (siehe Abbildung). Die Fragment-Enden werden daraufhin mit Biotin markiert und die Fragmente werden zirkularisiert. Die zirkularisierten Moleküle werden erneut fragmentiert und Biotin-markierte Fragmente werden angereichert. Die Sequenzierung der Biotin-markierten Fragmente generiert die gewünschten 'Outward-Facing' Read-Paare: Hierbei alinieren beide Reads nach außen gerichtet auf die Referenzsequenz. Die Entfernung beider Reads auf der Referenz liegt dabei zwischen 2 und 5 kbp.

Einige Punkte limitieren den Nutzen der Mate-Pair-Bibliotheken für ein qualitativ hochwertiges Scaffolding von Contigs.

1) 'Inward-Facing' Read-Paare: Die Sequenzierung von nicht markierten Fragmenten, die nicht erfolgreich weggewaschen wurden, produziert sogenannte Inward-Facing Reads (siehe Illumina’s Mate-Pair Sample Preparation Guide). Die Inward-Facing Reads verhalten sich wie Shotgun Paired-End Reads, da sie mit einer Spannweite von ca. 200-300 bp auf die Referenzsequenz alinieren.

2) Die Fragmentierung der zirkularisierten und Biotin-markierten Moleküle ist ein mechanischer Prozess und produziert daher Fragmente, die die Biotin-Markierung entweder in der Mitte des Fragments oder an einer anderen Position im Fragment tragen. Die Sequenzierung von Fragmenten, die die Biotin-Markierung in der Mitte des Fragments tragen, generiert die gewünschten 'Outward-Facing' Read-Paare. Wenn jedoch ein Fragment sequenziert wird, welches die Biotinmarkierung innerhalb der jeweils äußeren 100 bp des Fragments trägt, ist jeweils einer der beiden resultierenden Reads chimär. Der chimäre Read enthält Sequenzinformation von BEIDEN Seiten des ursprünglichen 3.5 kbp Fragments und es gibt keinerlei Anhaltspunkt darüber, an welcher Position in dem Read die Fusionsstelle liegt. Derartige Read-Paare sind für die Assemblierung wertlos und können sogar zu falschen Assemblierungen führen.

Für qualitativ hochwertiges Scaffolding mit Illumina HiSeq 2000 bietet Eurofins Genomics eine proprietäre Bibliothek als Alternative an, die sogenannte Long-Jumping-Distance-Bibliothek mit Spannweiten von 3kbp, 8 kbp, 20 kbp und sogar 40 kbp. Weiterlesen

 

 

Was ist eine Long-Jumping-Distance (LJD)-Bibliothek?

Long-Jumping-Distance (LJD)-Bibliotheken wurden von Eurofins Genomics entwickelt, um Scaffolding von Contigs im hohen Durchsatz zu ermöglichen. Die LJD-Bibliothek ist an die Sequenzierung mit dem Illumina HiSeq 2000 und dem Illumina MiSeq angepasst. Während die Mate-Pair-Bibliothek Spannweiten von 2 -5 kbp aufweist, weisen die LJD-Bibliotheken weit präzisere Spannweiten auf, welche die Assemblierung wesentlich verbessern. LJD-Bibliotheken werden mit Spannweiten von 3kbp, 8 kbp, 20 kbp und sogar 40 kbp angeboten.

Die LJD-Bibliothek weist gegenüber der Mate-Pair-Bibliothek weitere Vorteile auf. Zum einen ist aufgrund von Unterschieden in der Bibliothek-Herstellung der Anteil Shotgun Paired-End Reads stark reduziert. Nur ungefähr 1% der LJD reads sind Shotgun Paired-End Reads. Des Weiteren sind bei der LJD Bibliothek die beiden Sequenzen des ursprünglich 3 kbp, 8 kbp, 20kbp oder 40 kbp langen Fragments durch einen Adaptor voneinander getrennt. Hybrid-Reads, wie sie bei der Mate-Pair-Bibliothek vorkommen (siehe Erklärung in der Mate-Pair FAQ), sind bei der LJD Bibliothek also fast vollkommen ausgeschlossen. Die Fusionsstelle beider Sequenzen ist durch den Adaptor definiert.

 

Fragen zur Sequenzierung kleiner Genome und großer Konstrukte

Welches Probenmaterial benötigen Sie für die Sequenzierung von großen Vektor-Konstrukten, wie z.B. BACs, PACs, Fosmiden oder Cosmiden?

Bitte versenden Sie E. coli Glycerin- oder Stichkulturen, die das Vektor-Konstrukt enthalten.

Ist es möglich, die verbleibende BAC-, PAC-, Fosmid- oder Cosmid-DNA zu erhalten?

Ja. Auf Anfrage lassen wir Ihnen die verbleibende DNA zukommen. In diesem Fall müssen wir zusätzliche Kosten für die Abwicklung und den Versand berechnen.

Wie viel Probenmaterial benötigen Sie für die Sequenzierung von kleinen Genomen, wie z.B. Viren, Phagen oder Organellen-DNA?

Wir können Ihr Projekt mit nur 100-200 ng DNA durchführen. Eine geringe Kontamination mit genomischer DNA ist akzeptabel, solange diese unter 10% liegt. Trotzdem empfehlen wir den Versand von nicht kontaminiertem Probenmaterial, da dies das Auftreten von kontaminierenden Sequenzen verhindert.

Wir empfehlen wenn möglich den Versand von 5-10 µg Probenmaterial. In diesem Fall können wir auf die Amplifikation verzichten, die wir bei kleineren DNA-Mengen anwenden müssen.

Was bedeutet Coverage-Sequenzierung?

Bei der Coverage-Sequenzierung wird die DNA so lange sequenziert, bis eine bestimmte Menge an Sequenzinformation - und somit eine bestimmte Abdeckung der Sequenz - erreicht ist.

Beispiel: Für eine einfache Coverage (Abdeckung) eines BACs von 150 kb müssen 150.000 Basenpaare sequenziert werden. Für eine 6-fache Coverage ist die Sequenzierung von 900.000 Basenpaaren nötig.

 

Wie viele Läufe pro BAC, PAC, Fosmid oder Cosmid werden benötigt?

Das hängt von der Größe Ihrer BACs, PACs, Fosmide oder Cosmide und der benötigten Coverage ab.

Beispiel: Ein viertel Segment eines vollen Laufs ist ausreichend, um ein Set von 24 BACs von 150 kb mit einer 20-fachen Coverage zu sequenzieren.

Bitte beziehen Sie sich auf Ihr individuelles Angebot.

Wie liefern Sie die Sequenzierdaten?

In Abhängigkeit der Datenmenge erhalten Sie DVDs, USB-Sticks oder Festplatten.

Zusätzlich haben Sie die Möglichkeit, Ihre Daten von unserem "secure FTP" Server herunterzuladen.

Fragen zur Transkriptom-Sequenzierung

Welche Dienstleistungen bieten Sie für die Transkriptom-Sequenzierung an?

Welches Probenmaterial benötigen Sie für die Transkriptom-Sequenzierung?

Bitte senden Sie uns Gesamt-RNA.

Nach der ersten Qualitätskontrolle isolieren wir PolyA+ mRNA aus jeder RNA-Probe. Auf Anfrage isolieren wir auch Gesamt-RNA aus Geweben.

Wie viel RNA benötigen Sie für die Transkriptom-Sequenzierung?

Das hängt von der herzustellenden Bibliothek ab. Vor jeder Bankenherstellung führen wir eine Qualitätskontrolle der RNA Proben durch. Insgesamt werden deshalb für mRNA-Seq Banken mindestens 5 µg hoch-qualitativer RNA / Probe benötigt.

Darüberhinaus können Sie natürlich auch Projekte mit sehr geringen Mengen an Probenmaterial mit uns durchführen. Hierfür sprechen Sie uns bitte einfach an.

Welche Methoden der Konzentrations- und Qualitätsbestimmung für RNA empfehlen Sie?

Um Ihnen hochwertige Sequenzierdaten zukommen zu lassen, benötigen wir hochwertige Gesamt-RNA.

Für die Konzentrationsbestimmung Ihrer isolierten Gesamt-RNA empfehlen wir entweder spektrometrische Methoden, wie das NanoDrop-System oder Chip-basierte elektrophoretische Methoden, wie den Agilent 2100 Bioanalyzer. Abschätzungen über die RNA-Integrität können entweder mit traditioneller RNA-Gel-Elektrophorese oder mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer getroffen werden. In jedem Fall beginnen wir erst dann mit der Herstellung der Bibliothek, wenn Ihre RNA-Probe unsere Qualitätskontrolle erfolgreich bestanden hat.

Wie lange ist die Lieferzeit?

Die Lieferzeit hängt von Art und Größe Ihres Projekts ab. Ein Standard Projekt dauert im Normalfall 6-8 Wochen.

Bitte beziehen Sie sich für weitere Information auf Ihr individuelles Angebot.

Wie liefern Sie die Sequenzierdaten?

In Abhängigkeit von der Datenmenge erhalten Sie DVDs, USB-Sticks oder eine Festplatte.

Zusätzlich können Sie Ihre Daten auch von unserem "secure FTP" Server herunterladen.

Welche bioinformatischen Analysen bieten Sie für die Transkriptom-Sequenzierung an?

Typische bioinformatische Dienstleisungen nach einer Transkriptom-Sequenzierung sind: 

Fragen zur Sequenzierung kleiner RNAs

Wie viel Probenmaterial benötigen Sie für die Sequenzierung von kleinen RNAs?

Bitte senden Sie uns 10-20 µg Gesamt-RNA von jeder Probe. Das absolute Minimum sind 5-10 µg. Wir empfehlen Ihnen allerdings - wenn möglich - mehr Probenmaterial zu senden. Dadurch können wir umfangreichere Qualitätskontrollen und, falls notwendig, zusätzliche Wiederholungen durchführen.

Wie erstellen Sie die cDNA-Banken für die Sequenzierung |von kleinen RNAs mit dem HiSeq 2000?

Zunächst werden die kleinen RNAs durch Polyacrylamid-Elektorphorese aus der Gesamt-RNA isoliert. 3’- und 5’-Adaptoren werden an die kleinen RNAs ligiert und schließlich wird die cDNA-Bank durch Reverse Transkription (RT-PCR) und nachfolgende PCR-Amplifikationen erstellt.

 

Fragen zur Amplikon-Sequenzierung (v.a. 16S)

Welche Coverage (Abdeckung) ist für die Sequenzierung von Amplikons empfohlen?

Das hängt von dem Ziel Ihres Experiments ab.

  • Wenn Sie seltene Variationen mit einer Nachweisgrenze von 5% detektieren möchten, dann benötigen Sie eine 1000-fache Coverage.
  • Wenn Sie eine Nachweisgrenze von 1% erreichen möchten, dann benötigen Sie eine 5000-fache Coverage und so weiter.

Welche Spezies können mit Hilfe der 16S Mikrobiom-Analyse auf dem MiSeq detektiert werden?

Alle Bakterienspezies, die in der NCBI Nukleotiddatenbank publiziert sind, können auch bestimmt werden. Derzeit sind das tausende verschiedene Bakteriensequenzen. Es ist allerdings sehr schwierig sehr nah verwandete Spezies zu unterscheiden. Hier kann dann nur der Genus oder die Familie bestimmt werden.

Einschränkungen bei der Verwendung von NGS für die Mikrobiom-Analyse

  • Nah verwandte Spezies können aufgrund ihrer fast identischen Sequenz nicht sicher voneinander unterschieden werden.
  • Sehr starkt prozessierte Proben oder Proben mit einem sehr geringen pH enthalten zum Teil degradierte DNA. Dies macht eine Speziesbestimmung sehr schwierig und in manchen Fällen unmöglich.
  • Je mehr Ausgangsmaterial wir erhalten, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit gute Sequenzierergebnisse zu erzielen.

 

Wie hoch ist der Anteil an falsch positiven oder falsch negativen Ergebnissen?

Bei Proben mit stark degradierter DNA kann es sein, dass keine "Speziesidentifkation" möglich ist. Um falsch posistive Ergebnisse zu vermeiden, wird immer eine Negativkontrolle (Wasser) parallel zu den eigentlichen Proben prozessiert.

Mittels NGS kann jedes 16S DNA Amplikon, das erfolgreich amplifiziert wird auch detektiert werden. Aufgrund der hohen Sensitivität der Methode, müssen Sequenzen, die nur sehr selten in der Probe vorkommen (low coverage) oder Sequenzen mit unerwarteter Sequenzlänge in der Datenanalyse entfernt werden, um falsch positive Ergebnisse, die durch PCR oder Sequenzierfehler entstanden sind, auszuschließen. Spezies, die durch weniger als 0,5% aller Reads abgedeckt werden, werden somit nicht in den PDF Report aufgenommen.

Welche Art von Proben können mit NGS sequenziert werden?

Die klassische Analyse mittels Sanger Sequenzierung ist auf reine Proben oder Mischungen von maximal 2 Spezies beschränkt. Bei dem NGS Ansatz können Mischproben mit einer nicht einschränkbaren Anzahl verschiedener Spezies, sequenziert und analysiert werden.

Hinsichtlich des möglichen Ausgangsmaterials können Sie uns alles schicken, von Ready-to-Seq Amplikons, aufgreinigte DNA oder unterschiedlichstes Ausgangsmaterial.

Beispiel für verschiedene Ausgangsmaterialien:

  • Frische, geforene oder prozessierte (verpackt, in Öl eingelegt, gekocht (z. Bsp. Fertiggerichte) Lebensmittel- und Futterproben
  • Umweltproben (Erd-, Wasser, Stuhlproben ...)

Bitte beachten sie, dass verschiedene Prozessierungsschritte oder Zusatzstoffe im Falle von Lebensmittel- und Futterproben auch einen Einfluss auf die Qualität (Integrität) der bakteriellen DNA haben können. Spezielle saure Zutaten (wie Essig) degradieren die DNA. Die Proben sollten deshalb immer gekühlt oder gefroren veschickt werden.

Mindestmenge: 10g

 

 

Wie lange ist die Lieferzeit für die Sequenzierung eines typischen Amplikon-Projekts?

Die Lieferzeit für die Sequenzierung von Amplikons auf dem Illumina MiSeq beträgt maximal  20 - 30 Werktage nach Erhalt der Proben und aller notwendigen Informationen.

Wir bieten aber zusätzlich auch einen Express-Service an.

Fragen zur Resequenzierung mit Hilfe von Sequence Capture

Wie liefere ich die Zielsequenz für die Anreicherung?

Die vollständige Zielsequenz muss im FASTA- oder multiplen FASTA-Format geliefert werden. Bei nicht humanen Proben beträgt die minimale Zielsequenz 200 bp. Alle humanen Zielsequenzen <200 bp werden auf Basis der Humangenomsequenz (NCBI Daten auf UCSC) auf 200 bp vergrößert.

Die Zielregion für die Anreicherung kann entweder eine zusammenhängende Region sein oder aus mehreren unabhängigen Regionen bestehen (z.B. Exons). Die maximale Gesamtgröße der Zielsequenz ist durch das gewählte Array-Layout bestimmt.

Wie lange ist die Lieferzeit?

Die Lieferzeit ist von der Größe Ihres individuellen Projekts und der eingesetzten Sequenziertechnologie abhängig. Bitte beziehen Sie sich auf Ihr individuelles Angebot.

Welche Qualitätskontrollen führen Sie vor der Sequenzierung der angereicherten Proben durch?

Die verschiedenen Anreicherungsmethoden (mit Arrays oder in Lösung) enthalten eingebaute Kontroll-Oligonukleotide. Um die Funktionalität der Anreicherung sicherzustellen, führen wir mit der angereicherten und amplifizierten DNA eine qPCR auf die Kontrollregionen durch.

Kann ich Zielsequenzen aus anderen Organismen als dem Menschen selektiv anreichern?

Im Prinzip können individuelle Arrays für jeden beliebigen Organismus konzipiert werden, für den Referenzsequenzen vorliegen.

Wie viel Probenmaterial benötigen Sie für die Anreicherung?

Für die Sequenzanreicherung benötigen wir mindestens 5 µg genomische DNA. Bei den Anreicherungsmethoden von NimbleGen ist keine Amplifikation der DNA vor der Hybridisierung nötig. Potenzielle Bias-Quellen sind damit ausgeschlossen.

Welche Regionen können mit den Roche NimbleGen Anreicherungsmethoden angereichert werden?

Sie können eine beliebige Region auswählen für die Referenzsequenzen vorhanden sind, z.B. lange, durchgängige genomische Regionen, wie z.B. ganze Chromosomen oder nicht durchgängige Regionen, wie z.B. spezifische Exons oder ganze Exome.

Wer besitzt das Design eines Roche NimbleGen Arrays?

Roche NimbleGen besitzt die Designs von Roche NimbleGen Arrays.

Werden die Array-Designdaten für weitere Experimente mit demselben Design aufbewahrt?

Jedes Kunden Array Design wird von Roche NimbleGen aufbewahrt. Sie können in Zukunft weitere Arrays desselben Designs ohne zusätzliche Designkosten bestellen.

Ist es möglich die Anreicherungsarrays ein weiteres Mal zu nutzen?

Roche NimbleGen Anreicherungsarrays können nicht wiederverwendet werden.

Wie ist der Ablauf eines Anreicherungsexperiments mit Arrays oder in Lösung?

  1. Die SeqCap EZ Oligonukleotide werden für die ausgewählte Zielregion entworfen und produziert.
  2. Eine Standard Shotgun-Sequenzierbank wird aus genomischer DNA hergestellt.
  3. Die Sequenzierbank wird mit den SeqCap EZ Oligonukleotiden hybridisiert.
  4. Streptavidin Beads werden verwendet um den Komplex aus Oligonukleotiden und genomischen DNA Fragmenten zu binden.
  5. Ungebundene Fragmente werden durch Waschschritte entfernt.
  6. Die angereicherten Fragmente werden durch PCR amplifiziert.
  7. Die erfolgreiche Anreicherung wird durch qPCR auf Kontrollregionen festgestellt.
  8. Das Endprodukt ist eine für bestimmte Zielregionen angereicherte Sequenzierbibliothek, die mit Next Generation Sequenziertechnologien sequenziert werden kann.

NimbleGen Protocol

© 2009 Roche NimbleGen, Inc.

Wie ist der generelle Ablauf eines Anreicherungsprojekts mit Eurofins Genomics?

  1. Der Kunde wählt entweder ein etabliertes Human Exom Design oder eine beliebige genomische Zielregion für die Anreicherung aus.

  2. Wir veranlassen und erledigen für Sie das Array- oder Oligonukleotid-Design, die Produktion und den Datentransfer.

  3. Wir reichern Ihre genomischen Proben an und stellen die Sequenzierbibliothek her.

  4. Ihre angereicherten Proben können mit dem Illumina HiSeq 2500 sequenziert werden.

  5. Die bioinformatische Analyse beinhaltet das Mapping der Resequenzierungsdaten auf eine Referenzsequenz, SNP-Analysen, eine Qualitätsstatistik, eine Übersicht über die Abdeckung (Coverage), eine Statistik zu den Sequenzzahlen und weitere statistische Analysen.
    Ihre speziellen Anforderungen adressieren wir mit einem individuell zugeschnittenen Bioinformatikprojekt.

Fragen zur Bioinformatik

Benötige ich spezielle Software für die weitere Analyse meiner Sequenz-Daten?

Das hängt davon ab, was Sie untersuchen möchten. Sie benötigen spezielle Software für die Analyse der Rohdaten oder Assemblierungsdaten.

Für Softwareempfehlungen stehen wir Ihnen gerne zur Verfügung.

Was bedeutet Clustering?

Unter Clustering versteht man den bioinformatischen Prozess, um Sequenzen einer definierten Ähnlichkeit zu gruppieren. Im Unterschied zum Mapping kann das Clustering unabhängig von einer verfügbaren Referenz-Sequenz durchgeführt werden.

Routinemäßig wird Clustering durchgeführt, um

  • Expressionsprofile verschiedener mRNA-Proben zu vergleichen
  • Sequenzen aus Amplikon-Projekten zu gruppieren

Was ist eine de novo Assemblierung?

Eine de novo Assemblierung ist eine Assemblierung von Sequenzen unabhängig von der unterstützenden Information eines Referenz-Genoms von einem verwandten Organismus. Eine de novo Assemblierung kann daher im Vergleich zu der Sequenz des verwandten Organismus eine sehr unterschiedliche Sequenz liefern. Der Vorteil dieser Methode ist daher, dass größere Restrukturierungen, sowie Insertionen und Deletionen schnell detektiert werden können.

Was ist der Unterschied zwischen einem Scaffold und einem Contig?

„Zusammenhängende Nukleotid-Sequenzen“ (Contigs) werden bei Genom-Assemblierungen durch multiple Alignments von ähnlichen Einzel-Sequenzen gebildet. Nach den Alignments liegen multiple Konsensus-Sequenzen aller assemblierten Sequenzen vor, die die Contigs eines Genoms oder der Assemblierung darstellen.

Im Gegensatz dazu ist ein Scaffold eine geordnete Abfolge von Contigs, die durch die Paired-End-Information aus der Sequenzierung von Long-Jumping-Distance Banken oder Mate-Pair-Banken erstellt wird. Scaffolds bestehen immer aus einer Abfolge von Contigs, die durch Lücken voneinander getrennt sind. Diese Lücken können in der Konsensussequenz durch „NNNN“ dargestellt sein.

Was ist ein Mapping?

Im Gegensatz zu einer de novo Assemblierung ist eine auf Mapping basierende Assemblierung (mapped assembly) strikt von einer Referenz-Sequenz abhängig und beinhaltet den Vergleich von Sequenzen mit einer Referenz-Sequenz sowie das Mapping von ähnlichen Sequenzen auf die Referenz-Sequenz. Wenn die Einzel-Sequenzen überlappen, können auch Contigs gebildet werden. Das Mapping erlaubt das Studieren von Mutationen (z.B. SNPs) oder strukturellen Varianten.

Bieten Sie BLASTx- und BLASTn-Analysen an?

Ja. Wir bieten sowohl BLASTx- als auch BLASTn-Alignments gegen Protein- und Nukleotid-Datenbanken an.

Was ist der Unterschied zwischen einer BLASTx- und BLASTn-Analyse?

Bei der BLASTx-Analyse wird die DNA-Sequenz in alle möglichen Leserahmen translatiert und mit der nichtredundanten NCBI-Protein-Datenbank verglichen. Bei der BLASTn-Analyse wird die DNA-Sequenz mit einer ausgewählten Nukleotid-Datenbank verglichen.

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