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Häufig gestellte Fragen zu Produkten und Dienstleistungen


Assembly Techniken

Grundsätzlich gibt es drei verschiedene Ansätze für das Assembly synthetischer Gene.
In dem von Khorana (Gupta et al. 1968) entwickelten Ansatz wird eine Reihe von überlappenden Oligonukleotiden synthetisiert. Durch das Annealing der Oligonukleotide, bildet sich ein doppelsträngiges DNA-Fragment mit vereinzelten Lücken in beiden Strängen. Diese Lücken werden anschließend mittels einer DNA-Ligase geschlossen. Die DNA-Ligase ist ein Enzym, das eine Phosphordiester-Brücke zwischen dem 5`-Phosphat eines doppelsträngigen Oligonukleotidfragments und dem 3`-Hydroxyl-Ende eines anschließenden doppelsträngigen Oligonukleotidfragments bildet.

Ein zweiter, häufig angewandter Ansatz wurde von Narang (Scarpulla et al. 1982) entwickelt. Diese Methode macht sich der Template-gerichteten, Primer-abhängigen 5’-3’-Synthese-Fähigkeit der DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) zu Nutze. Nach Annealing der Enden der langen Oligonukleotide, füllt die Polymerase die Lücken mit dNTPs auf. Vereinzelte Lücken im Doppelstrang werden anschließend mit DNA-Ligase geschlossen.

Eine alternative Strategie basiert auf der Möglichkeit, sehr lange Oligonukleotidketten herstellen zu können. Bei diesem Ansatz (Rossi et al. 1982) werden zwei Oligonukleotide mit überlappenden 3’-Enden konstruiert. Dieses Konstrukt wird durch die DNA-Polymerase zum Doppelstrang vervollständigt. Nach der Polymerisation können überhängende Enden mittels Restriktionsverdaus generiert werden.

Gewöhnlich werden neu synthetisierte Fragmente und Gene anschließend in einen Vektor kloniert. Zu diesem Zweck ist es notwendig, bei dem Oligonukleotid-Design alle Klonierungsschritte zu beachten. Größere Fragmente können in Untereinheiten unterteilt werden, welche dann separat assembliert werden. Nach der Verifikation der Sequenzen der Untereinheiten werden diese zum Gesamtfragment assembliert.

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