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Häufig gestellte Fragen zu Produkten und Dienstleistungen


Wie werden Oligos bei Eurofins Genomics synthetisiert?

Oligos werden auf verschiedenen Synthesizern mittels Phosphoramiditchemie produziert. (Caruthers, M.H. (1983) Tetrahedron Lett. 24:245-248).
Die Oligonukleotide werden vom 3’- zum 5’-Ende hin synthetisiert während sie an einer Festphase kovalent gebunden sind (Festphasen Synthese). Die Bausteine für die DNA Synthese sind DNA Phosphoramidit Nukleoside, die mit unterschiedlichsten Schutzgruppen versehen sind.

synthesis cycle

Die Synthese startet mit „Deblocking“ (A), d.h. mit der Abspaltung der 5’ Dimethoxytrityl-Schutzgruppe.

Ein aktiviertes Phosphoramidit Nukleosid koppelt an die freie 5’ Hydroxylgruppe (B). Die Kopplungseffizienz liegt üblicherweise zwischen 98% und 99,5%. Da die Kopplungseffizienz keine 100 % beträgt, wird bei jedem Kopplungsschritt ein kleiner Prozentsatz an verkürzten Sequenzen mit produziert.

Wenn man solche Fehlsequenzen weiter reagieren lassen würde, würden ungewünschte Mutanten entstehen. Dieses Problem wird umgangen, indem die restlichen freien 5’ Hydroxylgruppen durch Acetylierung (C: Capping) inaktiviert werden.
Bei manchen Molekülen schlägt das Capping fehl. Diese nehmen so an weiteren Synthesezyklen teil, die dann zu fast vollständigen Molekülen mit internen Deletionen wachsen – die (n-x) Produkte.

Nach der Kopplung werden die DNA-Basen durch ein instabiles Phosphit Triester gebunden. Diese werden durch einen Oxidationsschritt (D) zu einer stabilen Phosphotriester Verbindung umgewandelt.
Der Oxidationsschritt vollendet einen Oligosynthesezyklus. Die DNA-Synthese kann durch das erneute Abspalten der DMT Gruppe am 5´-Ende der Kette fortgesetzt und ein neuer Zyklus gestartet werden.

Das Abspalten von der Festphase und das Entschützen der Oligonukleotide erfolgt unter basischen Bedingungen.

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