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Häufig gestellte Fragen zu Produkten und Dienstleistungen



Wie werden Oligos bei Eurofins Genomics synthetisiert?

Oligos werden auf verschiedenen Synthesizern mittels Phosphoramiditchemie produziert. (Caruthers, M.H. (1983) Tetrahedron Lett. 24:245-248).
Die Oligonukleotide werden vom 3’- zum 5’-Ende hin synthetisiert während sie an einer Festphase kovalent gebunden sind (Festphasen Synthese). Die Bausteine für die DNA Synthese sind DNA Phosphoramidit Nukleoside, die mit unterschiedlichsten Schutzgruppen versehen sind.

synthesis cycle

Die Synthese startet mit „Deblocking“ (A), d.h. mit der Abspaltung der 5’ Dimethoxytrityl-Schutzgruppe.

Ein aktiviertes Phosphoramidit Nukleosid koppelt an die freie 5’ Hydroxylgruppe (B). Die Kopplungseffizienz liegt üblicherweise zwischen 98% und 99,5%. Da die Kopplungseffizienz keine 100 % beträgt, wird bei jedem Kopplungsschritt ein kleiner Prozentsatz an verkürzten Sequenzen mit produziert.

Wenn man solche Fehlsequenzen weiter reagieren lassen würde, würden ungewünschte Mutanten entstehen. Dieses Problem wird umgangen, indem die restlichen freien 5’ Hydroxylgruppen durch Acetylierung (C: Capping) inaktiviert werden.
Bei manchen Molekülen schlägt das Capping fehl. Diese nehmen so an weiteren Synthesezyklen teil, die dann zu fast vollständigen Molekülen mit internen Deletionen wachsen – die (n-x) Produkte.

Nach der Kopplung werden die DNA-Basen durch ein instabiles Phosphit Triester gebunden. Diese werden durch einen Oxidationsschritt (D) zu einer stabilen Phosphotriester Verbindung umgewandelt.
Der Oxidationsschritt vollendet einen Oligosynthesezyklus. Die DNA-Synthese kann durch das erneute Abspalten der DMT Gruppe am 5´-Ende der Kette fortgesetzt und ein neuer Zyklus gestartet werden.

Das Abspalten von der Festphase und das Entschützen der Oligonukleotide erfolgt unter basischen Bedingungen.

Hat die Oligosequenz Einfluss auf den Erfolg einer Synthese?

Eurofins Genomics verfügt über eine jahrelange Erfahrung in der Synthese von Oligonukleotiden. Gelegentlich kommt es vor, dass Oligos aufgrund Ihrer Sequenz schwer zu synthetisieren sind, z. B. können Oligos mit einem hohem “G” Anteil („G-Stretches“) in der Synthese Schwierigkeiten bereiten. Zudem haben Oligos mit vier oder mehr aufeinanderfolgenden „Gs“ die Eigenschaft zu akkumulieren und einen „Guanin-Tetraplex“ zu bilden (Poon and MacGregor (1998) Biopolymers 45:427-434). Oligos mit selbst-komplementären Sequenzen tendieren dazu, Aggregate zu bilden, welche die HPSF, HPLC, und HYPUR Aufreinigung erschweren.

Was ist Synthese Maßstab und Synthese Ausbeute?

Der Synthese Maßstab bezeichnet die Menge an eingesetzem Startmaterial (CPG) bei der Festphasensynthese.

Dies ist nicht zu verwechseln mit der Synthese-Ausbeute, die von der Kopplungseffizienz während der Synthese abhängt.

Die Kopplungseffizienz ist wiederum stark von der Qualität der einzusetzenden Rohstoffe abhängig. Die Sequenz eines Oligos beeinflusst ebenfalls die Kopplungseffizienz und somit die Synthese-Ausbeute, wie die folgende Tabelle zeigt:

 Yield
CE 99.5%
Yield
CE 99.0%
Yield
CE 98.5%
20mer 91 83 75
30mer 86 75 65
40mer 82 68 55
60mer 74 55 41
100mer 61 37 22

Theoretische Ausbeute des Volllängenprodukts = Kopplungseffizienz (CE)

Wofür steht “OD”?

Der OD260 Wert (optische Dichte) einer DNA entspricht der Menge an DNA, die einen Absorptionswert von 1.0 bei einer Wellenlänge von 260 nm ergibt. Dies wird anhand einer in 1.0 ml ddH20 gelösten DNA-Probe in einer 1cm Quarzküvette über einen Reader ermittelt.
1 OD260 entspricht ungefähr 33 µg/ml einer Einzelstrang-DNA.

Warum sind Ausbeuten oft nicht reproduzierbar?

Es gibt viele Faktoren, die die Ausbeute beeinflussen können. Vorallem liegt es an der Oligolänge und an der Sequenz selbst (Basenkomposition).

Einer der Hauptgründe warum für das gleiche Oligo verschiedene Ausbeuten entstehen können, ist das Befüllen und Beladung der Synthesesäule mit CPG (controlled pore glass) Material, das für den Start der Synthese gebraucht wird. Die Mindestmenge an verwendetem CPG Material bezieht sich auf den Synthesemaßstab. Da aber Mengenschwankungen beim Befüllen nicht auszuschließen sind, kann es zu unterschiedlichen Ausbeuten kommen.

Wie lange sind unmodifizierte Oligos haltbar und wie sollten sie gelagert werden?

Unsere Stabilitätsstudien zeigen, dass unmodifizierte Oligos mehr als 6 Jahre stabil sind ,wenn man sie bei -20°C im lyophilisiertem Zustand lagert:

oligo stability table de

Die Stabilitätsstudie wurde mittels analytischer HPLC und MALDI-TOF MS sowie mittels DNA Sequenzierung durchgeführt.

Wenn Sie Ihre Oligos in sterilem Wasser oder in Puffer gelöst haben, oder Sie die Oligos bereits in dieser Form erhalten haben, empfehlen wir, die Oligos zu aliquotieren, die Aliquots zu lyophilisieren und bei mindestens -20°C zu lagern.

Um mehrfaches Einfrieren und Auftauen der Oligos zu vermeiden, sollten die Oligos, die gerade verwendet werden, bei +4°C im Kühlschrank aufbewahrt werden.

Wie lange sind Oligos im Allgemeinen haltbar?

Die Haltbarkeitszeit von Oligos wird von 3 Faktoren bestimmt:

1. PH-Sensitivität
Im Gegensatz zur doppelsträngigen DNA sind Einzelstrang Oligos empfindlicher gegenüber sauren pH-Werten. Daher sollte das Medium, das zum Lösen des Oligonukleotids verwendet wird, in einem basischen pH-Bereich liegen.

2. Nuklease-Abbau
Oligonukleotide können durch Nuklease-Aktivitäten degradieren. Dieser Nuklease-Abbau wird durch die Anwesenheit von Salz – insbesondere bei 2- wertigen und 3- wertigen Ionen – beschleunigt. Um die Aktivität von Nukleasen zu blockieren, können geeignete Hygienemaßnahmen am Arbeitsplatz sowie die Zugabe von geringen Mengen von Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) helfen.

3. Empfindlichkeit gegenüber Einfrieren und Auftauen
Die Qualität von Oligonukleotiden kann durch mehrfaches Einfrieren und Auftauen beeinträchtigt werden. Um dies zu vermeiden, empfiehlt es sich, diesen Prozess auf ein Minimum zu beschränken. Daher empfehlen wir die Oligos zu aliquotieren, die Aliquots zu lyophilisieren und bei mindestens -20°C zu lagern.

Wie kann die Haltbarkeit von Oligos optimiert werden?

Empfohlener Lösungspuffer

Für die Herstellung der Stammlösung empfehlen wir 10 mM Tris-EDTA; pH 8.0.
Die Arbeitslösung empfehlen wir mit Tris-Puffer zu verdünnen. Dadurch wird die Konzentration von EDTA, das bei enzymatischen Reaktionen stören kann, herabgesetzt.

Die Pufferkonzentration sollte der entsprechenden Oligomenge angepasst werden, da die DNA selbst bereits einen relativ hohen Säuregehalt besitzt. Der o.g. Puffer entspricht den Puffersystemen, die für molekularbiologische Applikationen wie PCR oder Sequenzierung empfohlen werden.

Salt Free und HPSF Oligonukleotide sollten nicht ungepuffert in destilliertem Wasser gelöst werden, da durch die nicht vorhandenen Salze, die diese Oligos mit sich bringen, keine eigene Pufferwirkung erzielt wird.
Zusätzlich empfehlen wir die Qualität des destilliertem Wassers, das für die Herstellung des Puffers verwendet wird, regelmäßig zu überprüfen.

Vermeidung von mehrfachem Auftauen und Einfrieren

Nach dem Lösen mit Tris-EDTA, sollten Oligonukleotide aliquotiert und bei -20°C gelagert werden. Einzelne Aliquots können auch in flüssiger Form bei +4°C im Kühlschrank aufbewahrt werden, wenn diese innerhalb von 1 bis 2 Tagen aufgebraucht werden.
Falls eine längere Aufbewahrungszeit (>6 Monate) nötig ist, empfehlen wir die Oligos im lyophilisiertem Zustand bei -80°C einzufrieren, um enzymatische Aktivitäten auszuschließen.
Nach unserer Erfahrung können Oligos, je nach Eigenschaft und in Abhängigkeit der Applikation, zwischen 1 Monat und 2 Jahren aufbewahrt werden.

Wie wähle ich die passende Farbstoffmarkierung?

Wird ein neuer Assay entwickelt, tritt meistens die Frage nach der bestmöglichen Fluoreszenzmarkierung auf. Die optimale Wahl lässt sich anhand der spektralen Eigenschaften jedes einzelnen Fluoreszenzfarbstoffes in Verbindung mit dem zu verwendenden Instrument treffen.

Jedes Gerät ist durch spezifischen Ausstattungsmerkmale gekennzeichnet, die es zu berücksichtigen gilt. Beispielsweise spielen die Energiequelle, optische Filter oder die Empfindlichkeit eine Rolle.

Welches sind die wichtigsten Eigenschaften, die geprüft werden sollten, um den passenden Farbstoff zu wählen? Hier sind Absorptions- und Emissionsspektren, der Stokes-Shift, der Extinktionskoeffizient, die pH- Sensitivität, die Stabilität gegenüber Photobleaching sowie die Quantenausbeute der Farbstoffe zu nennen.

Welche Kriterien sind bei der Auswahl des richtigen Farbstoffes zu beachten?

Absorptions- und Emissionsspektren von Farbstoffen
Der Absorptionswert gibt an, bei welcher Wellenlänge ein Farbstoff am stärksten sichtbares Licht oder UV-Licht absorbiert. Der Emissionswert gibt an bei welcher Wellenlänge eine Modifikation Licht bzw. Strahlung abgibt. Jede Farbstoffmodifikation hat seinen eigenen Absorptions- und Emissionswert (siehe Tabelle). Welches Absorptions- bzw. Emissionsspektrum eines Farbstoffes benötigt wird hängt von der Anwendung bzw. von der Art des Gerätes ab.

Stokes-Shift
Der Stokes-Shift ist die Differenz der Wellenlängen zwischen der absorbierten und der emittierten Fluoreszenzsignale. In der Regel ist ein großer Stokes-Shift erstrebenswert, da es bei der Verwendung von optischen Filtern einfacher ist, anregendes Licht und die Fluoreszenzemission voneinander zu trennen.

Extinktionskoeffizient
Dieser Wert beschreibt die Fähigkeit des Farbstoffs, Licht zu absorbieren. Die Absorbtionsfähigkeit hat einen eindeutigen Effekt auf die Menge an Licht, die der Farbstoff emittieren kann.

pH-Sensitivität
Manche Fluoreszenzfarbstoffe sind äußerst empfindlich gegenüber basischen oder sauren pH-Werten. Im alkalischen Bereich über pH 9 können bestimmte Farbstoffmoleküle degradieren. Andere Fluophore sind sowohl im sauren als auch im basischen pH-Bereich stabil. Eine der Ursachen dafür sind die strukturellen Gegebenheiten der Moleküle.

Stabilität gegenüber Photo Bleaching
Photobleaching sagt, dass bestimmte Farbstoffmoleküle unter ständiger Laserbestrahlung zerstört werden und ein Verlust der Fluoreszenz beobachtet werden kann. Durch den Verlust der Farbstoffintensität bzw. der Quantenausbeute können Experimente falsche Aussagen liefern.

Allerdings sollte auch das verwendete Gerät und die Art der Anwendung bei der Auswahl von Modifikationen berücksichtigt werden.

Die Stabilität gegenüber Photobleaching ist z. B. bei der DNA-Sequenzierung und in der Durchfluss-Cytometrie weniger wichtig als bei der Fluoreszenzmikroskopie.

Fluoreszenz-Quantenausbeute
Die Quantenausbeute (auch Quanteneffizienz genannt) beschreibt das Verhältnis zwischen der Anzahl von Prozessen, die durch Absorption von Photonen ausgelöst werden und der Anzahl der absorbierten Photonen selbst. In der Fluoreszenz gibt die Quantenausbeute eines Fluorophors das Verhältnis zwischen der Anzahl der emittierten und absorbierten Photonen an. In der Regel ist die maximale Quantenausbeute 1.0 (100%).

Die Quantenausbeute von Fluoreszenzfarbstoffen hängt stark von der jeweils existierenden Mikroumgebung ab. Z.B die des pH-werts, der Art der Lösung, Konzentration oder der Temperatur. Daher kann keine spezifische Quantenausbeute für einzelne Fluoreszenzfarbstoffe angegeben werden.

Kann ich unterschiedliche Modifikationen in einem einzelnen Oligo bestellen?

Wir bieten mehr als 100 unterschiedliche Modifikationen an.
Mehrere Kopplungen derselben Modifikation oder eine Mischung aus verschiedenen Modifikationen sind in einer einzelnen Oligosequenz möglich. Der Großteil der modifizierten Oligonukleotide wird mit kommerziell erhältlichen Phosphoramiditreagenzien hergestellt. Die Kopplungseffizienz und somit die Ausbeute dieser Phosphoramidite ist meist geringer als bei den normalen Nukleosid Phosphoramiditen. Je höher die Anzahl an Modifikationen und Modifikationskombinationen in einem Oligo und je länger die Oligosequenz ist, desto komplexer wird die Synthese und die Aufreinigung des Oligos.

Bitte kontaktieren Sie unser Customer Support Team, falls Sie Hilfe zur Bestellung von mehrfach modifizierten Oligos benötigen.

Kann ich unterschiedliche Backbone-Modifikationen in einem einzelnen Oligo bestellen?

Ja, jede Anzahl und Kombination von DNA und Phosphorthioat Bindungen (PTO) ist möglich.

Wie sollten Oligos mit Fluoreszenzfarbstoffen gelagert werden?

Für die Herstellung der Stammlösung empfehlen wir eine 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA Pufferlösung.

Bitte beachten Sie, dass Oligonukleotide, die mit einem CY-Farbstoff markiert sind, bei pH 7.0 stabil sind. Ein höherer pH-Wert würde dem Farbstoff schaden.

Die Arbeitslösung empfehlen wir mit Tris-Puffer zu verdünnen. Dadurch wird die Konzentration von EDTA, das bei enzymatischen Reaktionen stören kann, herabgesetzt.

Wir empfehlen die Oligos lyophilisiert bei mindestens -20°C zu lagern.
Wenn Sie Ihre Oligos in Puffer gelöst oder Sie die Oligos bereits in dieser Form erhalten haben, empfehlen wir die Oligos zu aliquotieren, die Aliquots zu lyophilisieren und bei mindestens -20°C zu lagern.

Um mehrfaches Einfrieren und Auftauen der Oligos zu vermeiden, sollten die Oligos, die gerade verwendet werden, bei +4°C im Kühlschrank aufbewahrt werden.
Zusätzlich empfehlen wir, farbstoffmarkierte Oligos grundsätzlich im Dunklen zu lagern und sie so wenig wie möglich dem Licht auszusetzen.

Wie sollten Oligos in Tubes und/oder Platten gelöst werden?

Für die Herstellung der Stammlösung empfehlen wir 10 mM Tris-EDTA; pH 8.0.
Die Arbeitslösung empfehlen wir mit Tris-Puffer zu verdünnen. Dadurch wird die Konzentration von EDTA, das bei enzymatischen Reaktionen stören kann, herabgesetzt.

Salt Free und HPSF Oligonukleotide sollten nicht ungepuffert in destilliertem Wasser gelöst werden, da durch die nicht vorhandenen Salze in diesen Oligos keine eigene Pufferwirkung erzielt wird.

Zusätzlich empfehlen wir die Qualität des destilliertem Wassers, das für die Herstellung des Puffers verwendet wird, regelmäßig zu überprüfen.

Die Standardkonzentration für Stammlösungen beträgt 100 µM. Sie finden die entsprechenden Angaben zum Lösungsvolumen auf unserem Synthesereport, der schon vor dem Eintreffen Ihrer Oligos in Ihrem Online-Account erhältlich ist.

In unserem Ecom System steht Ihnen zusätzlich ein kostenfreies Online-Tool (MOPS) zur Berechnung von Oligo Verdünnungen zur Verfügung.

Wie werden komplementäre Oligos annealed?

1. Lösen Sie die lyophilisierten Oligos in Wasser oder TE und verwenden Sie die Konzentration die auf den Oligo Synthesereports angegeben ist.


2. Addieren Sie folgende Komponenten:

Stock                                 Endkonzentration
Oligonukleotid 1                   100 nmole/ml
Oligonukleotid 2                   100 nmole/ml
10x Annealing-Puffer*           1x
Nucleasefreies Wasser         bis zu entsprechendem Volumen

*10x Annealing-Puffer: 100 mM Tris-HCI, pH 7.5,1 M NaCI and 10 mM EDTA.


3. Erhitzen Sie die Oligo-Lösung bis zu einer Temperatur, die 10°C höher ist als die berechnete Schmelztemperatur. Halten Sie diese Temperatur für 10 Minuten. Nehmen Sie die Lösung von der Heizplatte bzw. aus dem Wasserbad und lassen Sie diese langsam bis zur Raumtemperatur für ca. 1 Stunde auf dem Labortisch herunterkühlen.

Lagern Sie anschließend die annealten Oligos bei -20°C.

Wie sollen Thiol-Oligos behandelt werden?

Wir empfehlen das Thiol vor Verwendung des Oligos in Ihrer Applikation zu reduzieren:

1. Geben Sie dazu 200 µl 10mM TCEP (2,9mg TCEP-HCL in 1ml 1xTE Puffer, pH 8.0) auf Ihr Oligo

2. Schütteln Sie es 60 min bei Raumtemperatur

3. Fällen Sie das Oligo:

  • Geben Sie 150 µl 3 M Na-Acetate auf die Oligolösung [24,6 g Na-Acetate + 0,21 g Mg-Acetate in 100 ml dest. H2O]
  • Füllen Sie das Tube mit Ethanol p.a.
  • Schütteln Sie das Tube vorsichtig
  • Inkubieren Sie 20 min bei –20°C

4. Zentrifugieren Sie 5 min bei 13000 rpm und verwerfen Sie den Überstand

5. Lassen Sie das Pellet bei Raumtemperatur trocknen

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