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Häufig gestellte Fragen zu Produkten und Dienstleistungen


Was ist die Cycle Sequencing Technik?

Cycle-Sequencing, ist eine Modifikation der traditionellen Sanger-Sequenziermethode. Die Komponenten sind DNA, Primer, hitzebeständige DNA-Polymerase, 4 dNTP´s, 4 ddNTP´s (dideoxy terminator nucleotides) fluoreszenzmarkiert mit vier verschiedenen Farbstoffen sowie Puffer mit MG++ und K+-Ionen. Der einzelne Primer bindet an den komplementären DNA-Strang und wird in linearer Form verlängert. Diese Verlängerung wird so lange fortgeführt, bis zufälligerweise und abhängig von der komplementären Base ein bestimmtes ddNTP gekoppelt wird. Bedingt durch die Dideoxy-Beschaffenheit kann die Polymerase keine weitere Base mehr an diesem Fragment anfügen und die Verlängerung bricht ab.

Auf diese Weise erhält man am Ende einer definierten Anzahl an Zyklen eine Vielzahl an Fragmenten mit verschiedenen Längen und farbstoffmarkierten Enden.

Die stöchiometrische Beeinflussung der einzelnen Reaktionskomponenten stellt sicher, dass Fragmente jeder möglichen Länge generiert werden. Angenommen es werden 2.000 Basen generiert, dann erhalten wir alle Fragmente angefangen von n+1 bis 2.000, wenn n die Anzahl der Basen im Primer ist.

Der Hauptunterschied zwischen der traditionellen Sanger-Methode und der Cycle-Sequencing-Methode ist die Einführung der thermostabilen DNA-Polymerase. Der Vorteil dieser Polymerase ist, dass die Sequenzierreaktion immer wieder in demselben Tube wiederholt werden kann. Dabei wird das Reaktionsgemisch im Wechsel erhitzt und abgekühlt, einerseits um die DNA zu denaturieren und anderseits zum Annealen des Primers, um neue Sequenzketten zu bilden.

Aus diesem Grund wird weniger Template-DNA benötigt als bei konventionellen Sequenzierreaktionen.

Nach der Aufreinigung der Sequenzierreaktionen werden die Proben elektrokinetisch in die Kapillaren des 96-Kapillarsequenzierers injiziert.

Die negativ geladenen Fragmente wandern der Größe nach geordnet die Anode entlang, wobei die kleinsten Fragmente am schnellsten sind. Durch ihre angehängten ddNTP-Terminatoren kann die Basensequenz des Fragments gelesen werden.

Ein Laserstrahl regt in dem Moment, in dem die Fragmente das Detektionsfenster erreichen diese Farbstoffmoleküle an und produziert somit Fluoreszenzsignale. Diese Signale werden von allen 96 Kapillaren gleichzeitig gesammelt, spektral voneinander getrennt und auf eine CCD (charge-coupled device) Kamera fokussiert.

Äußerst hochentwickelte optische und elektronische Apparate produzieren ein farbiges Schema, das mit Hilfe einer Sequenzanalysesoftware in eine lesbare Sequenz übersetzt wird.

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