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Häufig gestellte Fragen zu Produkten und Dienstleistungen



Was ist eine BLASTx-Analyse? Welche Daten erhalte ich?

BLAST (Abk. für engl. Basic Local Alignment Search Tool) ist der Überbegriff für eine Sammlung der weltweit am häufigsten genutzten Programme zur Analyse biologischer Sequenzdaten.
Mit BLASTx werden experimentell ermittelte DNA-Sequenzen mit bereits vorhandenen Sequenzen verglichen, die in der nicht redundanten Protein-Datenbank von NCBI abgelegt sind. Dieser Service wird verwendet, um eine potentielle Translation einer unbekannten Nukleotidsequenz zu finden.

Was ist der IUPAC Code? Welche Ergebnisse erhalte ich?

Die DNA-Basenidentifikation beruht auf der Nomenklatur, die von der International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) ausgegeben wurde. Bei nicht eindeutiger Basenidentifikation werden folgende IUPAC-Codes verwendet:

G/T = K C/T = Y A/C/G = V
A/G = R A/C = M C/T/G/ = B
G/C = S A/G/T = D A/C/G/T = N
A/T = W A/C/T = H

Was ist die Platten-Ergebnisübersicht (plate result summary)?

Die “plate result summary” ist eine Übersicht über die Ergebnisse aller sequenzierten Proben pro Platte. Diese beinhaltet in entsprechender Reihenfolge den Namen der jeweiligen Probe und deren Wellposition, die Leselänge nach dem Quality Clip, die Positionen der Quality Clips und den Qualitätswert der gesamten Sequenz.

Was sind Q20 (Q30 / Q40) Basen?

Eurofins Genomics verwendet ein Basecalling-Programm, dass jeden Peak jeder Base einzeln untersucht und anhand dessen an jede Base einen Qualitätswert (Q) vergibt. Qualitätswerte variieren im Bereich von 4 bis ca. 60, je höher der Wert, desto höher die Qualität.

Die Qualitätswerte haben einen logarithmischen Bezug zu Fehlerwahrscheinlichkeiten in der Sequenz. Eine Aufstellung sehen Sie in folgender Tabelle:

QualitätswertWahrscheinlichkeit einer falsch gelesenen BaseSequenzgenauigkeit
Q 10 1 in 10 90 %
Q 20 1 in 100 99 %
Q 30 1 in 1.000 99.9 %
Q 40 1 in 10.000 99.99 %
Q 50 1 in 100.000 99.999 %

Welche Sequenziermethode setzt Eurofins Genomics ein?

Für alle Custom Sequencing Services setzen wir die Cycle Sequencing Technologie (dideoxy chain termination / cycle sequencing) auf ABI 3730XL-Sequenzern ein.

Was ist die „Cycle Sequencing“ Technik?

Cycle-Sequencing, ist eine Modifikation der traditionellen Sanger-Sequenziermethode. Die Komponenten sind DNA, Primer, hitzebeständige DNA-Polymerase, 4 dNTP´s, 4 ddNTP´s (dideoxy terminator nucleotides) fluoreszenzmarkiert mit vier verschiedenen Farbstoffen sowie Puffer mit MG++ und K+-Ionen. Der einzelne Primer bindet an den komplementären DNA-Strang und wird in linearer Form verlängert. Diese Verlängerung wird so lange fortgeführt, bis zufälligerweise und abhängig von der komplementären Base ein bestimmtes ddNTP gekoppelt wird. Bedingt durch die Dideoxy-Beschaffenheit kann die Polymerase keine weitere Base mehr an diesem Fragment anfügen und die Verlängerung bricht ab.

Auf diese Weise erhält man am Ende einer definierten Anzahl an Zyklen eine Vielzahl an Fragmenten mit verschiedenen Längen und farbstoffmarkierten Enden.

Die stöchiometrische Beeinflussung der einzelnen Reaktionskomponenten stellt sicher, dass Fragmente jeder möglichen Länge generiert werden. Angenommen es werden 2.000 Basen generiert, dann erhalten wir alle Fragmente angefangen von n+1 bis 2.000, wenn n die Anzahl der Basen im Primer ist.

Der Hauptunterschied zwischen der traditionellen Sanger-Methode und der Cycle-Sequencing-Methode ist die Einführung der thermostabilen DNA-Polymerase. Der Vorteil dieser Polymerase ist, dass die Sequenzierreaktion immer wieder in demselben Tube wiederholt werden kann. Dabei wird das Reaktionsgemisch im Wechsel erhitzt und abgekühlt, einerseits um die DNA zu denaturieren und anderseits zum Annealen des Primers, um neue Sequenzketten zu bilden.

Aus diesem Grund wird weniger Template-DNA benötigt als bei konventionellen Sequenzierreaktionen.

Nach der Aufreinigung der Sequenzierreaktionen werden die Proben elektrokinetisch in die Kapillaren des 96-Kapillarsequenzierers injiziert.

Die negativ geladenen Fragmente wandern der Größe nach geordnet die Anode entlang, wobei die kleinsten Fragmente am schnellsten sind. Durch ihre angehängten ddNTP-Terminatoren kann die Basensequenz des Fragments gelesen werden.

Ein Laserstrahl regt in dem Moment, in dem die Fragmente das Detektionsfenster erreichen diese Farbstoffmoleküle an und produziert somit Fluoreszenzsignale. Diese Signale werden von allen 96 Kapillaren gleichzeitig gesammelt, spektral voneinander getrennt und auf eine CCD (charge-coupled device) Kamera fokussiert.

Äußerst hochentwickelte optische und elektronische Apparate produzieren ein farbiges Schema, das mit Hilfe einer Sequenzanalysesoftware in eine lesbare Sequenz übersetzt wird.

Was ist der Qualitätsreport?

In dem Qualitätsreport (*.pdf Format) bestehend aus den ABI-Trace-Dateien werden die Qualitätswerte jeder einzelnen Base farbig unterhalb jedes Peaks dargestellt. Jede der vier verschiedenen Farben repräsentiert jeweils einen spezifizierten Qualitätsbereich.

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