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PROD | u6.1.6
 

 

Häufig gestellte Fragen zu Produkten und Dienstleistungen



Wie soll ich meine Sequenzierproben einsenden?

Sie finden alle Informationen bezüglich Probenaufbereitung, DNA- und Primerkonzentration sowie Transportempfehlungen auf den jeweiligen Produktseiten unter "Probenversand”.

Wie ermittle ich die Konzentration meiner Probe(n)?

Ermitteln Sie die optische Dichte (OD) mit einem Spektrophotometer bei 260nm und 280nm.

Um reproduzierbare und zuverlässige Ergebnisse zu erzielen, sollte der OD260-Wert zwischen 0,05 und 0,8 liegen. Das OD 260/280-Verhältnis sollte 1,8 sein. Werte unter 1,6 bzw. höher als 2,0 sind ein Hinweis auf Kontaminationen in der Probe, die die Konzentrationsbestimmung negativ beeinflussen und höchstwahrscheinlich zu schlechten Sequenzierergebnissen führen.

Wir empfehlen zusätzlich eine OD-Messung bei 230nm und 320nm. Ein hoher OD320-Wert deutet eine eventuelle Kontamination an. Der Wert sollte idealerweise bei 0,0 liegen. Das OD 230/260-Verhältnis sollte kleiner als 0,6 sein.

Um sich der Qualität Ihrer DNA ganz sicher zu sein, empfehlen wir eine zusätzliche Kontrolle mittels Agarosegel.

Welche Aufreinigungsmethode(n) soll ich verwenden?

Für Plasmide empfehlen wir kommerziell erhältliche Mini Scale Präparations-Kits. Erfahrungsgemäß wird die DNA-Qualität und somit das Sequenzierergebnis verbessert, wenn der Waschschritt wiederholt wird.
Bitte senden Sie keine DNA, die mit Hilfe alkalischer Lyse oder Boiling-Methode nach Holmes und Quigley, 1981 ohne anschließende Säulchenreinigung isoliert wurde.

Für PCR-Produkte sollten kommerziell erhältliche PCR-Aufreinigung „Spin Column Kits“ verwendet werden.

Kann ich meine DNA in Tris-EDTA (TE) einsenden?

Nein, bitte nicht.

EDTA bindet bivalente Kationen wie Magnesium (Mg++), die essentiell für die Taq-Polymerase sind. DNA ist über mehrere Tage in bi-destilliertem Wasser oder Tris-HCl bei Raumtemperatur stabil. In getrocknetem Zustand ist DNA sogar noch länger haltbar. Falls Sie Ihre DNA trotzdem in Tris-EDTA lagern möchten, entnehmen Sie vorab ein Aliquot des Eluats und senden dieses an unsere Sequenzierabteilung.

Sollte ich meine DNA auf Trockeneis versenden?

Das ist nicht notwendig; DNA ist über mehrere Tage in bi-destilliertem Wasser oder Tris-HCl bei Raumtemperatur stabil. Bitte lösen Sie Ihre DNA keinesfalls in Tris-EDTA, da dies negative Auswirkung auf die Taq-Polymerase hat.

Kann ich ungereinigte PCR-Produkte oder Klone einsenden?

Ja.

Wir bieten für alle Custom Sequencing Services DNA-Präparationen und PCR-Produktaufreinigungen als zusätzliche Dienstleistung an. 

Welche E.coli Stämme soll ich verwenden?

Obwohl der verwendete Stamm signifikanten Einfluss auf die DNA-Qualität haben kann, sind die meisten E.coli Stämme zur DNA-Isolierung geeignet.

Bakterienstämme wie DH10b, DH5 alpha, XL10 Gold und TOP10 liefern in Kombination mit vielen der kommerziell erhältlichen DNA-Präparations-Kits in der Regel eine hohe DNA-Qualität und gelten daher für die Plasmid-Sequenzierung als sehr geeignet.

Eine schlechtere DNA-Qualität liefern Stämme, die hohe Mengen an Kohlehydraten produzieren, welche dann während der Lyse freigesetzt werden und Enzymaktivitäten blockieren. Beispiele sind HB101 und dessen Derivate wie beispielsweise TG1 und die JM100 Serie.
Auch Stämme mit mittleren oder hohen Endonukleaseaktivitäten wie beispielsweise der HB101, JM101 oder BL21 produzieren DNA mit geringerer Qualität. In diesem Fall sollte eine Proteinase-K-Behandlung in Betracht gezogen werden.

Ist es notwendig mein PCR-Produkt aufzureinigen, wenn nur eine Bande zu sehen ist?

Das Produkt muss von Primer- und dNTP Rückständen befreit sein. Vorhandene Primerrückstände führen zu Mischsequenzen – bereits ein fünfprozentiger Anteil an Primer führt bereits zu unleserlichen Mischsequenzen. Die dNTPs würden die dNTP/ddNTP-Konzentration in der Sequenzierreaktion beeinflussen. Wir empfehlen daher die Aufreinigung mit kommerziell erhältlichen PCR-Aufreinigungs- „Spin Column“ Kits“.

Ich sehe unspezifische Banden in meiner PCR-Reaktion. Sollte ich mein Produkt über ein Gel aufreinigen?

Falls Sie Ihren PCR-Primer in der Sequenzierreaktion verwenden wollen, ist es notwendig Ihr PCR-Produkt über ein Agarose-Gel aufzureinigen. Andernfalls erhalten Sie eine Mischsequenz, da sich Ihr Primer höchstwahrscheinlich an beide Produkte, d.h. sowohl dem spezifischen als auch dem unspezifischen, binden wird.
Wenn Sie einen spezifischen Nested Primer für die Sequenzierung einsetzen wollen, könnte das auch ohne vorherige Aufreinigung funktionieren.
Die beste Garantie für ein gutes Sequenzierergebnis ist allerdings nach wie vor, dass sich nur ein Produkt in der PCR-Reaktion befindet. Um unspezifische PCR-Produkte zu vermeiden, hilft es bereits in den meisten Fällen die PCR-Konditionen anzupassen (z.B. Primer-Design, höhere Annealing-Temperatur und/oder geringere Primer Konzentration).

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